白色念珠菌生物膜细胞外囊泡：传递念珠菌溶素并调控宿主细胞反应的关键角色

《Infection and Immunity》：Candida albicans biofilm extracellular vesicles deliver candidalysin to epithelial cell membranes and induce host cell responses

本文聚焦白色念珠菌（Candida albicans）感染。研究发现生物膜细胞外囊泡（EVs）含有念珠菌溶素（candidalysin），虽不能损伤口腔上皮细胞（OECs），却可诱导细胞因子反应。且 24h 和 48h 的 EVs 功能有差异，为了解白色念珠菌致病机制提供新视角。

　　### 白色念珠菌生物膜细胞外囊泡研究背景
细胞间通讯依赖多种分子，其中细胞外囊泡（EVs）是重要参与者。革兰氏阴性菌利用外膜囊泡（OMVs）输送毒素，真菌如白色念珠菌也能产生 EVs 。念珠菌溶素（candidalysin）是白色念珠菌感染的关键毒力因子，由ECE1基因编码，可激活宿主免疫反应。此前虽发现白色念珠菌生物膜 EVs 中存在 Ece1p（念珠菌溶素的前体蛋白），但成熟念珠菌溶素是否存在于 EVs 及其作用机制尚不清楚。本研究旨在探究白色念珠菌生物膜 EVs 是否含有念珠菌溶素，以及这些 EVs 能否作为念珠菌溶素的有效传递系统影响宿主上皮细胞。

白色念珠菌生物膜细胞外囊泡中存在念珠菌溶素

研究人员从野生型（WT）白色念珠菌 SN250 菌株培养 24h 和 48h 的生物膜中分离出 EVs（分别记为 WT - 24H 和 WT - 48H） 。通过电子显微镜观察到 EV 样结构，并检测到 EV 特异性标记物 Hse1 和 Vps27。利用液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）分析发现，WT - 24H 和 WT - 48H 的 EVs 中存在大量对应成熟念珠菌溶素的肽谱匹配（PSM）值，而敲除ECE1基因、无法产生念珠菌溶素的突变株（ece1Δ/Δ）的 EVs（ece1Δ/Δ - 24H 和ece1Δ/Δ - 48H）则无或仅有少量 PSM 值，这表明白色念珠菌生物膜 EVs 中存在念珠菌溶素。

含念珠菌溶素的 EVs 体外不损伤人类口腔上皮细胞

由于念珠菌溶素是已知的唯一能直接诱导上皮细胞损伤的白色念珠菌因子，研究人员以乳酸脱氢酶（LDH）活性为指标，检测含念珠菌溶素的 EVs 对口腔上皮细胞（TR146 OECs）的损伤作用。将 WT - 24H、WT - 48H、ece1Δ/Δ - 24H 和ece1Δ/Δ - 48H 的 EVs 以 3×10¹²颗粒 /mL（p/mL）的浓度作用于 OECs 24h 后，未观察到细胞损伤；作用 48h 后同样未发现损伤。这说明在实验条件下，EVs 中的念珠菌溶素可能功能受限，或者其传递到 OECs 的量不足，无法引起细胞损伤。

含念珠菌溶素的 EVs 诱导人工膜融合和通透

为进一步探究生物膜 EVs 中念珠菌溶素的功能，研究人员将 EVs 作用于由 1,2 - 二植烷酰 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸胆碱（DPhPC）脂质构成的两性离子脂质双层膜，监测膜融合和膜通透情况。当 EVs 与脂质双层膜相互作用时，观察到两种电流变化：可逆的短峰和永久的电流下降，分别代表膜融合和膜通透。动力学分析显示，WT - 24H 和 WT - 48H 的 EVs 均能以浓度依赖的方式诱导膜通透。例如，WT - 24H 的 EVs 在 5×10¹² p/mL 时诱导膜通透的速度比 1×10¹² p/mL 时快四倍；WT - 48H 的 EVs 通透动力学比 WT - 24H 的 EVs 慢四倍。通过与合成念珠菌溶素对比，估算出 WT - 24H 的 EVs 在 1×10¹² p/mL 时约含 2μM 念珠菌溶素，WT - 48H 的 EVs 在相同浓度下约含 0.5μM。而念珠菌溶素缺陷的 EVs（ece1Δ/Δ - EVs）表现出浓度无关的膜通透，表明其与 DPhPC 脂质双层膜的相互作用较弱或非特异性。

24h 和 48h 获得的含念珠菌溶素的 EVs 以依赖和不依赖念珠菌溶素的方式诱导细胞因子产生

虽然 WT 的 EVs 对 OECs 无损伤作用，但研究人员推测其中的念珠菌溶素可能仍能诱导先天免疫反应。将 3×10¹² p/mL（约相当于 6μM 念珠菌溶素）的 EVs 作用于上皮细胞，监测细胞因子的产生。结果显示，24H 和 48H 的 EVs 都能诱导大量粒细胞集落刺激因子（G - CSF）、粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM - CSF）和白细胞介素 - 1β（IL - 1β）分泌，效果与 15μM 合成念珠菌溶素相当。ece1Δ/Δ - 24H 的 EVs 无法诱导细胞因子反应，说明 EVs 中的念珠菌溶素可诱导细胞因子产生；而ece1Δ/Δ - 48H 的 EVs 却能诱导与 WT - 48H 的 EVs 相似水平的细胞因子反应，这表明 48H 的 EVs 生物膜可能不依赖念珠菌溶素就能触发细胞因子产生。

24h 和 48h 获得的含念珠菌溶素的 EVs 货物和去污剂敏感性不同

WT - 24H 和 WT - 48H 的 EVs 虽念珠菌溶素 PSM 值相近，但膜通透动力学和细胞因子反应不同。研究人员猜测这可能是由于 24h 和 48h 的 EVs 分子货物组成不同。通过串联质谱（LC - MS/MS）比较货物蛋白质组，发现 24H - EVs 中有 59 种独特蛋白质，与菌丝生长或膜运输相关。此外，研究人员还推测 EV 膜组成差异可能影响含念珠菌溶素的 EVs 膜通透活性。用 0.1% Triton X - 100 处理 24h 和 48h 的 EVs 后，通过动态光散射（DLS）测量发现，WT - 24H 的 EVs 半径从 170±40nm 减小到 70±20nm，表明膜破裂；而 WT - 48H 的 EVs 半径从 130±30nm 变为 120±50nm，基本不变且波动增加，表明具有抗性。念珠菌溶素缺陷的ece1Δ/Δ - 48H 的 EVs 经处理后半径也无变化。脂质组学分析还发现，24H - EVs 中麦角固醇（ERG）、二酰甘油（DAG）和三酰甘油（TAG）等脂质含量更高，这些脂质对调节膜流动性至关重要。综合来看，较不成熟的 24h 生物膜 EVs 可能更有利于念珠菌溶素传递到 OEC 膜诱导细胞因子产生；成熟的 48h 生物膜 EVs 虽含念珠菌溶素，但以不依赖念珠菌溶素的方式激活 OEC 细胞因子产生，二者功能存在差异。

讨论

细菌、真菌和寄生虫病原体产生的 EVs 含有毒力因子，可与宿主细胞相互作用促进疾病进展。本研究首次直接证明白色念珠菌生物膜 EVs 中存在念珠菌溶素，其能诱导人工膜通透和 OEC 适度免疫激活，但不引起 OEC 损伤，可能是由于念珠菌溶素浓度不足或其功能受 EVs 内构象和位置影响。不同成熟度（24h 和 48h）的含念珠菌溶素的生物膜 EVs 生物学活性不同，这与蛋白质货物和脂质组成差异有关。24H - EVs 中独特蛋白质和较高的某些脂质含量使其膜流动性更高，更易诱导膜融合和通透；48H - EVs 则相反。在白色念珠菌感染过程中，念珠菌溶素可能以 “游离” 和 EV 包裹两种形式存在，“游离” 念珠菌溶素可直接损伤 OEC 获取营养，而 EV 传递的念珠菌溶素可能具有 “宿主细胞启动” 等未知功能，宿主上皮细胞也可能通过感知分泌的 EVs 优化对白色念珠菌感染的反应。本研究揭示了 EVs 在白色念珠菌感染中的多功能作用，为深入理解其致病机制提供了重要依据。