独特组氨酸激酶 AtcS 调控牙龈卟啉单胞菌运动性与致病性的关键作用探究

《独特的组氨酸激酶 AtcS 调节牙周致病菌齿垢密螺旋体的运动性和致病性》一文，构建了齿垢密螺旋体（T. denticola）的atcS基因缺失突变株，发现该突变株转录组改变，运动性、齿龈蛋白酶（dentilisin）活性等降低，致病力减弱，对深入了解其致病机制意义重大。

　　

研究背景

牙周病是一种由微生物群落失调引发慢性炎症，进而破坏牙齿支持结构的疾病。在美国，近一半 30 岁及以上成年人受牙周炎影响，全球超 10% 成年人口患有 IV 期牙周炎，不仅导致牙齿缺失，还降低生活质量。牙周炎患者患心血管疾病、II 型糖尿病等全身性疾病的风险也显著增加，且治疗费用高昂。

牙周炎发展过程中，口腔微生物群落发生显著变化，从以革兰氏阳性、兼性微生物为主，转变为以革兰氏阴性细菌和螺旋体为主的更具多样性的失调群落。齿垢密螺旋体（T. denticola）是一种厌氧螺旋体，属于牙周致病菌，在牙周炎发展中起重要作用。它能附着并侵入牙龈组织，引发促炎反应，与口腔癌症相关。

齿垢密螺旋体为适应动态环境，需感知并响应环境变化。其分子信号传导策略尚不完全清楚，但已知它利用双组份系统（TCSs）、核苷酸第二信使 c-di-GMP 和 c-di-AMP 等。TCS 是细菌中常见的信号传导系统，由组氨酸激酶和反应调节因子组成，能感知环境刺激并调节基因表达或酶活性。齿垢密螺旋体基因组编码多个 TCS，但对其功能了解有限。

AtcS（组氨酸激酶；TDE0032）和 AtcR（反应调节因子；TDE0033）组成的 TCS 在生长后期和稳定前期表达上调。AtcS 的调控机制不明，AtcR 含有独特的 LytTR DNA 结合域。此前研究暗示 AtcR 可能调节运动相关基因等，但 AtcSR 系统在齿垢密螺旋体适应性反应中的作用未被深入研究。此外，齿垢密螺旋体还依赖其他毒力因子，如齿龈蛋白酶（dentilisin）和主要外鞘蛋白（Msp）等，参与营养获取、免疫逃避和感染建立。

研究方法

1. 构建 ΔatcS菌株：通过等位基因交换，将atcS（tde0032）基因替换为含ermB盒的片段，构建 ΔatcS菌株。经 PCR 和 qRT-PCR 验证基因缺失情况，且确认不影响atcR和tde0034的表达。
2. 基因组分析：培养 ATCC 35405 和 ΔatcS菌株 4 天后，提取基因组 DNA 进行测序。利用 Illumina 测序技术，对测序数据进行处理和分析，识别单核苷酸多态性（SNPs）和基因组变异。
3. PCR 和定量逆转录（qRT）-PCR：采用 PCR 检测基因存在与否，以基因组 DNA 为模板，使用基因特异性引物和 Phusion 聚合酶，产物经琼脂糖凝胶电泳分析。qRT-PCR 用于评估基因表达，提取 RNA 后去除 DNA，合成 cDNA，以 16S rRNA 为内参，按照 2^?ΔΔC_T方法计算 mRNA 表达水平。
4. 转录组学：培养 ATCC 35405 和 ΔatcS菌株 4 天，收集细胞提取 RNA。对 RNA 进行质量检测、核糖体去除等处理后，构建 RNA-seq 文库并测序。使用 DESeq2 包分析差异表达基因，相关数据可通过 Gene Expression Omnibus（GEO；GSE277225）获取。
5. 运动性测定：采用半固体 NOS 琼脂（0.5% Noble 琼脂）进行群体运动实验，将细菌悬液接种于平板，厌氧培养 4 或 8 天后测量菌斑直径，评估菌株运动性。
6. 趋化性测定：采用毛细管管法测定齿垢密螺旋体对葡萄糖和血红素的趋化反应。将细胞悬液与趋化因子置于厌氧环境中孵育，通过暗视野显微镜计数毛细管内的螺旋体数量，评估趋化性。
7. SAAPFNA 水解实验检测齿龈蛋白酶活性：以 SAAPFNA 为底物，测定齿垢密螺旋体野生型和突变株的齿龈蛋白酶活性。将菌株培养至指数生长期，调整菌液浓度后与底物反应，通过检测 405nm 处吸光度变化评估蛋白酶活性。
8. 流式细胞术检测对 TIGK 细胞的附着和侵袭：用 CellBrite-488 荧光膜染料标记细菌，与 TIGK 细胞共孵育，通过流式细胞术检测细菌对 TIGK 细胞的附着情况；使用 Cytek Amnis Imagestream MKII 检测细菌的附着和侵袭，分析相关数据。
9. 流式细胞术评估细胞凋亡：用 Annexin V 结合物和碘化丙啶（PI）染色，通过流式细胞术分析 TIGK 细胞感染齿垢密螺旋体后的凋亡情况。将细胞与细菌共孵育后，进行染色和流式细胞术检测，使用 FlowJo 软件分析数据。
10. 小鼠牙槽骨丧失实验：选用 8 - 10 周龄 BALB/c 小鼠，分为不同实验组，分别接种 ATCC 35405、ΔatcS菌株或对照组。感染 6 周后，对小鼠颅骨进行微计算机断层扫描（μCT），测量牙槽骨嵴（ABC）与釉牙骨质界（CEJ）之间的距离，评估牙槽骨丧失情况。
11. 统计分析：使用 GraphPad Prism 10.3.1 软件进行统计分析，根据实验情况选择t检验或单因素方差分析（ANOVA），并结合 Tukey 或 Dunnett 多重比较检验评估数据差异。

研究结果

1. ΔatcS菌株生长缺陷：构建的 ΔatcS菌株在生长前 48 小时与亲本菌株 ATCC 35405 生长情况相似，但从第 3 天开始至第 5 天，生长出现约 20% 的下降。这表明 AtcS 对维持齿垢密螺旋体体外生长适应性至关重要。
2. 转录组变化：比较 ΔatcS菌株和 ATCC 35405 的转录组，发现 449 个差异表达基因（±0.5 log2 倍变化 [log2FC]，错误发现率 < 0.05），占蛋白编码基因的 17.7%。差异表达基因在转运系统和运动性、趋化性相关基因方面变化显著。ABC 转运蛋白相关基因大多下调，但部分基因（如TDE2429 - TDE2431）上调。多数运动性相关基因下调，部分趋化性相关基因表达改变。
3. 对运动性和趋化性的影响：ΔatcS菌株群体运动实验中菌斑直径显著小于野生型，表明运动性降低。对葡萄糖和血红素的趋化实验中，ΔatcS菌株虽能向趋化因子迁移，但迁移水平低于野生型。经标准化处理后，发现两者趋化性无显著差异，说明 ΔatcS菌株迁移差异主要由运动性降低导致。
4. 齿龈蛋白酶复合物基因表达和活性降低：RNA-seq 和 qRT-PCR 分析显示，ΔatcS菌株中齿龈蛋白酶复合物基因（prtP、prcA和prcB）表达显著降低。体外实验中，ΔatcS菌株齿龈蛋白酶活性较 ATCC 35405 降低约 25%，虽差异有统计学意义，但可能对齿龈蛋白酶生物学作用影响较小。
5. 与牙龈上皮细胞互作受影响：由于 ΔatcS菌株运动性和齿龈蛋白酶表达降低，其与牙龈角质形成细胞（TIGK）的互作能力减弱。流式细胞术检测发现，ΔatcS菌株对 TIGK 细胞的附着和侵袭能力均低于野生型，且感染后细胞凋亡情况与野生型无显著差异。这表明 AtcS 依赖的信号传导主要影响细菌对牙龈上皮细胞的附着，对侵袭和细胞凋亡影响较小。
6. AtcS 对致病性的影响：在小鼠牙槽骨丧失模型中，野生型齿垢密螺旋体可诱导显著的牙槽骨丧失，而 ΔatcS菌株则无明显影响。这表明 AtcS 是齿垢密螺旋体介导小鼠牙周炎模型中牙槽骨丧失所必需的，对其致病性有重要贡献。

研究讨论

AtcS 和 AtcR 形成的 TCS 仅存在于齿垢密螺旋体和相关菌株中。AtcS 作为膜结合组氨酸激酶，无明显传感结构域，其传感功能可能与跨膜结构域有关，类似Bacillus subtilis中的 BceS 激酶。研究发现，ΔatcS菌株中 ABC 转运蛋白表达失调，这可能与 AtcS 激活机制相关，有待进一步研究。

AtcR 是螺旋体中唯一含 LytTR - DNA 结合域的反应调节因子，其功能研究存在困难，目前无法敲除atcR基因，可能与基因下游的甲基化位点有关。本研究虽描述了基因表达差异，但 AtcR 对基因表达的直接调控机制仍需进一步探索。

ΔatcS菌株生长缺陷可能与齿龈蛋白酶活性降低影响氨基酸代谢，以及参与甘氨酸代谢的基因下调有关。未来研究可关注 AtcS/R 在调节齿垢密螺旋体中心代谢中的作用。

运动性对齿垢密螺旋体至关重要，它有助于细菌在口腔环境中生存、定植、逃避吞噬、侵袭宿主组织和获取营养。ΔatcS菌株运动性降低，影响其在口腔中的多种生物学功能。齿龈蛋白酶在牙周病中发挥重要作用，可降解细胞外基质、破坏免疫反应和促进炎症。ΔatcS菌株齿龈蛋白酶活性降低，影响其与宿主细胞的互作，但具体机制仍需深入研究。

此外，以往齿垢密螺旋体基因敲除难以互补，近期虽有新的遗传工具，但本研究通过构建多个独立的 ΔatcS克隆和基因组测序，证实了观察到的表型是由atcS基因缺失引起的。

本研究增进了对 AtcS 在齿垢密螺旋体生理和致病性中作用的理解，但仍存在许多未知。未来研究将聚焦于 AtcS 活性调节机制、AtcR 的全面功能以及 AtcS/R 对其他信号转导系统的影响，同时探索其在生物膜形成和多微生物相互作用中的作用。