无标记富集高转移性肿瘤起始细胞至单克隆状态：开启癌症研究新征程

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Label-Free Enrichment of Highly Metastatic Tumor-Initiating Cells up to a Monoclonal State

本文介绍了一种基于形态学的球体分析（MBSA）无标记方法，可富集高表达肿瘤起始细胞（TIC）/ 转移标记（CD44 和 CD54）的侵袭性 TIC 群体。通过实验证明其在肿瘤形成和转移方面的作用，为癌症研究提供新的细胞培养方法和研究思路。

　　### 研究背景
癌症干细胞（Cancer Stem Cells，CSCs）是癌细胞中的特殊亚群，具备自我更新、启动肿瘤生长以及分化的能力，在肿瘤的发展、转移和复发过程中扮演关键角色。耗尽肿瘤中的 CSCs 能够抑制癌症转移，因此，靶向 CSCs 成为预防肿瘤扩散的关键。不过，CSCs 没有标准的生物标志物，且与正常干细胞标记大多重叠，导致识别和分离困难，现有分离技术也难以保证细胞纯度。本文提出一种无标记方法，旨在富集具有高侵袭性的 TIC 群体，推动癌症研究进展。

材料和方法

1. 细胞培养：非小细胞肺癌 TS32 细胞（TS32-R0），由 Dr. Bing Lim 合作提供，使用含多种成分的标准培养基进行培养。
2. 单细胞制备：对培养的球体进行离心，利用特定试剂解离细胞，再经清洗、过滤得到单细胞悬液。
3. 基于形态学的球体分析（MBSA）：将 TS32-R0 单细胞接种培养，7 天后用机械移液器挑选 100 - 200μm 的圆形球体，制成单细胞后再次接种培养，依此循环，按挑选轮次标记细胞。
4. 抗体和试剂：实验所用抗体购自不同供应商，并按说明用金属标签标记。
5. 质谱流式细胞术（Mass Cytometry）：样本经多种处理步骤，包括染色、洗涤、固定等，最终用 Helios 质谱流式细胞仪检测。
6. 质谱流式细胞术数据分析：数据经归一化处理后上传至特定软件，通过手动选门和特定算法分析。
7. TS32-TiY⁺细胞分选：TS32-R0 单细胞用肿瘤起始探针黄色（TiY）染色，经洗涤、重悬后用流式细胞仪分选。
8. 体内肿瘤形成和大小评估：将不同细胞悬液皮下注射到 6 月龄 NOD scid gamma（NSG）小鼠腹部，4 周后取出肿瘤评估。
9. 转移模型：把不同细胞悬液静脉注射到 8 周龄 NSG 小鼠眼中，8 周后取器官检测转移情况。
10. 组织成像：冷冻组织切片后进行苏木精 - 伊红（H&E）染色或免疫组化染色，用荧光显微镜观察。

结果与讨论

1. TICs 的富集工具：基于形态学的球体分析：TiY 虽能选择性染色 TICs，但会降低细胞活力，影响肿瘤球体生长。MBSA 通过控制肿瘤球体形态和大小，经多轮挑选，在第 9 轮（TS32-R9）获得均一性良好的细胞群体。
2. 高纯度 TIC 群体的 CyTOF 分析：质谱流式细胞术（CyTOF）分析显示，TS32-R9 细胞系中 CD44、CD54、CD9 和 CD73 等 TIC 和转移生物标志物的表达水平高于 TS32-R0 细胞系。
3. TS32-R9 通过异种移植模型形成肿瘤的能力：皮下注射实验中，TS32-R9 组在所有注射位点（6/6）均形成肿瘤，且肿瘤体积更大，优于 TS32-R0 组和 TS32-TiY⁺组。
4. 高纯度 TIC：TS32-R9 的转移潜力：静脉注射实验中，TS32-R9 注射的小鼠体重下降最多，且仅该组在肺和甲状腺出现肿瘤转移，免疫组化证实肿瘤源于 TS32-R9 细胞，表明 MBSA 可富集具有高转移潜能的 TICs。

结论

MBSA 是一种基于球体形态和物理特征选择的方法，虽存在人工操作易有偏差、耗时耗力等局限，但能富集高纯度且具有高侵袭性和转移性的 TICs。在缺乏稳定的患者来源 TIC 细胞系以及特异性检测肺肿瘤 TICs 的生物标志物的情况下，MBSA 有望成为新的 TIC 培养方法，为临床研究提供支持。