丁香假单胞菌亚群时空协作助力植物感染机制新探：鞭毛与 III 型分泌系统的动态调控

为探究细菌表型异质性对植物病原体的影响，研究人员以丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）为对象，研究其鞭毛和 III 型分泌系统（T3SS）表达。结果发现二者存在表型异质性及反调控，影响细菌生长，支持 “分工” 模型。该研究揭示细菌定殖植物机制，为防控植物病害提供理论依据。

　　在微生物的奇妙世界里，细菌与环境的互动一直是科学家们热衷探索的领域。以往人们常认为，细菌在面对环境变化时，基因激活是整齐划一的。但越来越多的研究发现，即使是克隆群体中的细菌，在很多特性上也会表现出差异，也就是表型异质性。对于动物病原体而言，这种表型异质性对其致病性的影响已有所了解。然而，在植物病原体领域，这仍是一个未解之谜。丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）作为一种能让 500 多种植物患病的 “植物杀手”，在农业生产中危害极大。它能在叶片表面生存，也会通过伤口或气孔钻进叶片内部的细胞间隙（质外体）搞破坏。此前研究发现，丁香假单胞菌的 III 型分泌系统（T3SS）在植物体内的表达存在差异，但其鞭毛表达情况以及这两个系统之间的关系还不清楚。为了解开这些谜团，来自西班牙马拉加大学 - 西班牙高等科学研究理事会（IHSM-UMA-CSIC）等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Microbiology》杂志上，为我们理解植物病原体的致病机制打开了新的大门。
研究人员采用了多种技术方法来开展这项研究。在菌株构建方面，构建了携带不同荧光标记融合基因的丁香假单胞菌菌株，用于观察相关基因的表达。利用流式细胞术（Flow cytometry）和显微镜技术，对细菌的单细胞水平特征进行分析，包括监测基因表达的异质性、细菌的生长情况等。还通过竞争指数（CI）测定等实验，研究细菌在不同条件下的生长差异。
研究结果如下：

1. 鞭毛表达的异质性：研究人员构建了 fliC::GFP3 转录融合菌株，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流式细胞术发现，在体外培养基和植物叶片表面，丁香假单胞菌的鞭毛表达存在差异，部分细菌表达鞭毛（Flagella^ON），部分不表达（Flagella^OFF）。从植物质外体分离的细菌中，鞭毛表达的细胞间差异更明显。并且，fliC 表达与细菌运动性呈正相关，说明鞭毛在丁香假单胞菌中存在表型异质性12。
2. 鞭毛和 T3SS 的反调控：使用携带 fliC::tdT 和 hrpL::GFP3 转录融合的菌株，同时评估 T3SS 和鞭毛的表达。发现这两个系统在体外培养基中均呈异质表达，且存在四种表达组合的亚群，其中 T3SS^ON/Flagella^OFF和 T3SS^OFF/Flagella^ON亚群相对更丰富，表明二者存在反调控3。
3. 表达对细菌生长的影响：通过竞争指数测定实验发现，T3SS 表达会使细菌生长受限，例如 ΔhrpL 突变体在 T3SS 基因不表达的富培养基中生长优于野生型，而在 T3SS 基因表达的培养基中则相反。鞭毛表达也存在生长代价，ΔhrpL ΔfliC 双突变体比野生型生长优势更明显。单细胞水平分析也证实，fliC 表达与细菌生长呈负相关45。
4. 微菌落发育中的表型特化：在质外体微菌落发育过程中，早期微菌落中 T3SS 表达异质，鞭毛不表达；随着时间推移，鞭毛和 T3SS 荧光呈现区域化分布，靠近宿主细胞表面的细菌主要是 T3SS^ON，远离的则主要是 Flagella^ON，说明细菌在微菌落发育过程中存在表型特化现象67。
5. Flagella^ON细菌的主动退出：研究发现，随着感染时间延长，Flagella^ON细菌数量增加，且在感染早期，从叶片中主动退出的细菌主要是 Flagella^ON细菌，这表明鞭毛运动不仅有助于细菌进入叶片，还能帮助它们在坏死前快速主动离开感染组织8。
   研究结论和讨论部分指出，丁香假单胞菌鞭毛调控与沙门氏菌有相似之处，都存在细胞间随机变化。T3SS 和鞭毛表达的生长代价为表型异质群体提供了选择优势，这种异质性可能减少群体展示的鞭毛蛋白量，有利于逃避植物防御和促进免疫抑制。研究还支持了 “分工” 模型，T3SS^ON细菌通过分泌效应蛋白抑制植物免疫，帮助 T3SS^OFF细菌生长，而 Flagella^ON细菌则能在感染后期离开组织，寻找新的生存空间。该研究首次在植物宿主环境下，同时研究两个与细菌 - 宿主相互作用相关的位点，揭示了细菌在植物体内的分工协作和合作致病机制，为理解细菌在复杂环境中的生存策略提供了新视角，也为开发更有效的植物病害防控策略奠定了理论基础。