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在微生物群落中，水平基因转移（HGT）通过质粒传播耐药基因等，危害巨大。现有抑制 HGT 的工具存在诸多局限。研究人员开展了针对特定结合性质粒的研究，构建 DoS 质粒。结果显示 DoS 能有效消除多种质粒，这为控制微生物群落基因传播提供了新工具。
在微生物的微观世界里，一场 “基因战争” 正在悄然上演。水平基因转移（Horizontal Gene Transfer，HGT）就像一把双刃剑，它能让细菌之间共享有益的基因，促进微生物群落的发展，但同时也成为了一些 “坏基因” 传播的帮凶。其中，结合性质粒（conjugative plasmids）在这场基因传播中扮演着关键角色，它们能携带抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）等有害基因，在不同细菌间肆意穿梭。想象一下，细菌们就像一个个微小的 “运输工”，通过结合作用（conjugation），将这些抗性基因传递给原本没有抗性的同伴，使得越来越多的细菌变得 “刀枪不入”，这给医疗领域带来了巨大的挑战。
目前，为了应对结合性质粒传播带来的问题，科学家们尝试了许多方法。比如使用化学药剂来消除质粒，但这些化学药剂往往 “不分敌我”，在抑制目标质粒的同时，也会对其他有益的质粒产生影响，而且它们的效果还因不同的质粒和宿主而差异巨大。还有利用工程质粒的方法，像基于不相容性原理或 CRISPR-Cas9 技术来靶向质粒，但这些方法在应用范围和精准度上也存在不足。
为了突破这些困境，来自未知研究机构的研究人员开展了一项极具创新性的研究。他们提出了一种名为 denial-of-spread（DoS）的策略，旨在精准地靶向并消除特定的结合性质粒。研究人员构建了一种特殊的工程质粒 ——DoS 质粒，它就像一个训练有素的 “基因杀手”，专门针对携带不良基因的结合性质粒发起攻击。
研究人员在研究中用到了多种关键技术方法。他们通过构建数学模型，模拟 DoS 干预的不同阶段，为实验设计提供理论指导。在实验操作中，利用基因编辑技术，如 PCR 和 Gibson 组装等构建不同版本的 DoS 质粒，并通过液体培养实验观察 DoS 质粒在微生物群落中的作用，研究其对结合性质粒的消除效果。
设计原理（Design principle of DoS plasmids）
研究人员基于之前建立的质粒持续潜力（plasmid persistence potential，ω）的定量指标，设计了 DoS 质粒。DoS 质粒编码了与目标质粒相同的转移起始位点（oriT）、不相容性决定序列（inc）以及抗生素抗性基因（ARG）。oriT 可以使 DoS 质粒通过 Retrotransfer 进入含有目标质粒的宿主细胞，并抑制目标质粒的进一步转移；inc 能使 DoS 质粒与目标质粒不相容，在细胞分裂时确保二者分离；ARG 则可以通过调整抗生素浓度，赋予 DoS 质粒生长优势。通过构建动力学模型进行数值模拟，结果证实 DoS 在多种条件下能够消除原本会在系统中持续存在的结合性质粒。
利用 DoS 1.0 消除广泛宿主范围的质粒 RP4（Elimination of the broad host range plasmid RP4 using DoS 1.0）
为了验证 DoS 策略的可行性，研究人员构建了 DoS 1.0 来靶向 RP4 质粒。RP4 质粒具有快速的转移速率、广泛的宿主范围，还能传播多种抗生素抗性，是一个极具代表性的研究对象。实验中，研究人员将含有 DoS 1.0 的 Top10 大肠杆菌细胞引入含有 RP4 的 MG1655 大肠杆菌常驻群体中，定期传代并监测其种群和质粒动态。结果发现，DoS 1.0 成功消除了 RP4 质粒。在实验初期，由于氯霉素（Cm）的选择作用，DoS 1.0 具有生长优势，它通过 Retrotransfer 进入 MG1655 细胞后，抑制了 RP4 质粒的转移和遗传，使得 MG1655 DoS 1.0 细胞逐渐在混合群体中占据主导地位。当 RP4 被完全消除后，由于失去了 Cm 的选择压力，DoS 1.0 也因自身的适应性成本而从 MG1655 细胞中消失，最终得到了不含质粒的 MG1655 细胞群体。实验还表明，DoS 1.0 设计中的每个部分，如 oriT、inc 和抗生素选择，对于 RP4 的消除都是必不可少的。
利用优化后的 DoS 2.0 消除 RP4（Elimination of RP4 using the optimized DoS 2.0）
尽管 DoS 1.0 在实验中取得了成功，但它消除目标质粒和自身去除所需的时间较长，限制了其更广泛的应用。为了加速这一过程，研究人员进行了筛选实验，优化了实验条件，确定了较弱的稀释率（<10,000×）和较高的 Cm 浓度（≥6 μg/ml）可以加速 DoS 介导的质粒消除过程。在此基础上，研究人员构建了 DoS 2.0，它引入了一个自杀模块，包含来自酿酒酵母的限制性内切酶 I-SceI 及其切割位点，在添加外源性无水四环素（aTc）后，DoS 2.0 可以诱导质粒自杀从而快速被消除。实验结果显示，在优化条件下，DoS 2.0 仅用 7 天就消除了 RP4 质粒，随后通过诱导自杀，在 3 天内就将自身从系统中去除，相比 DoS 1.0，效率大大提高。而且，DoS 2.0 在非充分混合的条件下同样能有效地消除 RP4 质粒，表明良好的混合系统并非其发挥作用的限制条件。
用定制的 DoS 质粒消除多种结合性质粒（Elimination of diverse conjugative plasmids with tailored DoS plasmids）
为了评估 DoS 策略的通用性，研究人员设计了针对不同结合性质粒的 DoS 变体，包括 pOX38、R388 和 pCU1。这些质粒分别属于不同的不相容性组，具有不同的结合机制和 oriT 序列。研究人员使用优化后的 DoS 2.0 实验参数对这些变体进行评估，结果发现每个 DoS 变体都能在 9 天内完全消除其目标结合性质粒，并在诱导 DoS 自杀后的 7 天内自身被消除。不过，不同质粒的消除过程存在差异，例如 pOX38 的消除变异性较大，可能与 Retrotransfer 效率较低有关；R388 和 pCU1 的消除速度与结合效率相关，且 pCU1 在被消除后似乎仍对细胞生长有影响。
在多种质粒混合群落中选择性消除目标质粒（Selective curing of target plasmid in mixed communities of multiple plasmids）
研究人员进一步研究了 DoS 在多种质粒混合群落中选择性消除目标质粒的能力。他们将含有 DoS 2.0（DoS-RP4）的 Top10 细胞引入含有 RP4（目标质粒）和 pOX38（非目标质粒）的 MG1655 细胞共培养体系中。实验结果表明，DoS-RP4 能够选择性地消除 RP4，而 pOX38 在实验过程中始终存在。虽然观察到少量同时含有 pOX38 和 DoS-RP4 的细胞，但这并不影响 DoS 对目标质粒的特异性消除，证明了 DoS 介导的消除作用具有高度的特异性。
用于消除 RP4 的模块化和通用 DoS 设计（Modular and versatile DoS design for RP4 elimination）
为了展示 DoS 设计的模块化和通用性，研究人员构建了 DoS 3.0。DoS 3.0 通过将 DoS 2.0 中的 inc 序列替换为靶向 RP4 上 β- 内酰胺酶的 CRISPR-Cas9 系统，并切换 I-SceI 启动子为 pBAD，在 pTet 启动子下编码 CRISPR-Cas9。实验采用了四阶段处理方案，结果显示 DoS 3.0 成功地以与早期 DoS 版本相似的效率消除了 RP4 质粒，进一步证明了 DoS 设计的灵活性。
研究结论和讨论部分表明，DoS 系统是一种受基因驱动启发的平台，用于微生物群落中可移动基因的靶向控制。它具有高度的特异性，能够在最小化对其他质粒干扰的情况下，精准地抑制或消除目标质粒。同时，诱导自杀机制为其提供了额外的控制手段，当 DoS 对群落稳定性产生较大影响时，可以迅速将其从系统中去除。此外，DoS 系统还为研究质粒与宿主之间的相互作用提供了有力的工具，通过选择性地去除目标质粒，创建不含质粒的宿主群体，有助于深入了解质粒和宿主各自对表型特征的贡献。然而，DoS 系统在实际应用中也面临一些挑战，例如需要足够的序列信息来构建最佳匹配的 DoS 质粒，自然质粒中存在的毒素 - 抗毒素系统可能会影响 DoS 的效果，Retrotransfer 的变异性和较慢的速率也可能限制 DoS 的应用。尽管如此，随着技术的不断发展和优化，DoS 平台在质粒生物学、医学和微生物组工程等领域仍具有广阔的应用前景。该研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上，为微生物基因调控研究开辟了新的道路，有望为解决抗生素抗性基因传播等问题提供新的思路和方法。
