ABCB1：p53null卵巢癌铂耐药的关键靶点与潜在治疗新方向

《Cell Death Discovery》：ABCB1 confers resistance to carboplatin by accumulating stem-like cells in the G2/M phase of the cell cycle in p53null ovarian cancer

为探究卵巢癌铂耐药机制，CHA University 研究人员开展 ABCB1 在 p53null卵巢癌中作用的研究。结果发现 ABCB1 可使细胞周期阻滞于 G2/M 期并积累干细胞样细胞，ΔNp73 可调控 ABCB1。这为克服卵巢癌铂耐药提供新靶点，有望改善患者生存率。

　　在女性健康领域，卵巢癌是个令人头疼的 “大麻烦”。它是全球范围内妇科恶性肿瘤中预后最差、死亡率最高的疾病之一。即便现在诊断技术和治疗方案不断进步，晚期卵巢癌患者 5 年生存率仍徘徊在 30% 左右，其中化疗耐药是重要阻碍。铂类 - 紫杉烷联合化疗是卵巢癌治疗的 “金标准”，但多数携带 TP53 基因突变的高级别卵巢浆液性癌患者，常因化疗耐药在一线治疗后 6 个月内复发，中位总生存期不足一年。TP53 基因作为肿瘤抑制因子，在细胞周期调控、DNA 修复和细胞凋亡等过程中起着关键作用。可不同 TP53 突变类型与化疗耐药间的分子机制却一直不明确，这就像在黑暗中摸索，找不到精准治疗的方向。为了打破这一困境，CHA University 的研究人员挺身而出，开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Death Discovery》上，为卵巢癌治疗带来了新希望。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是细胞实验技术，培养人卵巢腺癌细胞系 SKOV3 和 OVCAR3，并诱导出卡铂耐药细胞系；二是分子生物学技术，如定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）、免疫印迹分析、RNA 测序（RNA - seq）等，用于检测基因和蛋白表达；三是 RNA 干扰技术，通过转染小干扰 RNA（siRNA）敲低 ABCB1 和 ΔNp73 基因；四是借助公共数据库分析临床数据，探究 ABCB1 表达与患者无进展生存期（PFS）的关系。
研究结果如下：

1. 卡铂耐药使 p53^null人卵巢癌细胞获得更多干细胞样特征：研究人员通过连续 20 代用卡铂处理 SKOV3 和 OVCAR3 细胞，构建卡铂耐药细胞系。SKOV3 细胞 TP53 基因 H179R 点突变，无 p53 蛋白表达，属于 p53^null细胞；OVCAR3 细胞 TP53 基因 R248Q 点突变，表达总 p53 和磷酸化 p53 蛋白。实验发现，卡铂耐药的 SKOV3（carR - SKOV3）细胞形态发生变化，更具间充质细胞特征，增殖和迁移能力增强，对额外卡铂处理耐受性更高。同时，carR - SKOV3 细胞干细胞相关蛋白水平显著增加，而 carR - OVCAR3 细胞与非耐药的 OVCAR3（nonR - OVCAR3）细胞相比无明显差异，这表明获得性耐药伴随的干细胞样特性与卵巢癌细胞中 TP53 基因突变状态有关。
2. 卡铂耐药使 p53^null卵巢癌细胞积累于细胞周期 G2/M 期，呈现更高的干细胞特征：研究人员利用流式细胞术分析细胞周期分布，发现 p53^null的 SKOV3 细胞在对卡铂产生耐药后，G2/M 期细胞比例显著增加，同时 G0/G1 期细胞 DNA 含量减少。carR - OVCAR3 细胞周期分布与 nonR - OVCAR3 相似。进一步研究各细胞周期阶段亚群的干细胞特征，发现 carR - SKOV3 细胞在 G2/M 期积累的细胞中，所有干细胞相关标志物表达均显著增加，而 G0/G1 和 S 期细胞无明显变化。carR - OVCAR3 细胞在各细胞周期阶段的干细胞样特性差异不明显。此外，carR - SKOV3 细胞 G2/M 期 Ki67 阳性细胞比例显著增加，carR - OVCAR3 细胞则无此变化。这些结果表明，p53^null卵巢癌细胞在获得卡铂耐药后，多数会在 G2/M 期停留更长时间，并获得更多干细胞样特征。
3. ABCB1 在铂耐药 SKOV3 细胞中高表达：研究人员分析之前的数据集（GSE173579），发现 ABCB1 基因在 carR - SKOV3 组中表达上调。通过基因本体（GO）富集分析和基因集富集分析（GSEA），发现 ABCB1 基因参与干细胞增殖和细胞周期 G2/M 期转换等信号通路。分析公共数据集（GSE83440、GSE98559 和 GSE148003）也证实，顺铂耐药的 SKOV3 细胞中 ABCB1 表达高于顺铂敏感细胞，且顺铂耐药的 SKOV3 细胞中 CCNB1 和 CDK1 基因表达也更高，这些结果都支持了 carR - SKOV3 细胞更多积累在 G2/M 期的结论。
4. ABCB1 诱导的 G2/M 期积累细胞的干细胞样特征赋予 p53^null卵巢癌对卡铂的耐药性：研究人员通过 siRNA 转染敲低 ABCB1，发现 carR - SKOV3 细胞生长速率显著降低，Ki67 阳性细胞比例减少，但细胞周期分布无明显变化。重要的是，ABCB1 抑制使 G2/M 期积累的 carR - SKOV3 细胞中高水平的干细胞蛋白表达逆转至 nonR - SKOV3 细胞水平，G2/M 期 Ki67 阳性细胞比例也大幅下降。这表明 ABCB1 抑制可显著降低 G2/M 期积累的 carR - SKOV3 细胞的干细胞样特征，而不影响细胞周期进程。
5. 致癌性 ΔNp73 驱动由上调的 ABCB1 赋予的耐药表型：TP73 基因编码的 ΔNp73 可抑制 TAp73 和 p53 活性，且有研究报道 ΔNp73 可调节 ABCB 家族基因表达。研究人员发现 carR - SKOV3 细胞中 ΔNp73 在 mRNA 和蛋白水平均高于 nonR 细胞。敲低 ΔNp73 后，ABCB1 表达显著下降，carR - SKOV3 细胞生长速率和 Ki67 阳性细胞数量明显减少，对高剂量卡铂诱导的额外 DNA 损伤更敏感，细胞存活率与 nonR - SKOV3 细胞相似。这表明致癌性 ΔNP73 是 ABCB1 的上游调节因子，抑制它可逆转 SKOV3 细胞的卡铂耐药表型。
6. ABCB1 抑制通过恢复 G2/M 期积累细胞减弱的 DNA 修复活性，使卡铂耐药的 SKOV3 细胞重新敏感：研究人员发现，ABCB1 抑制后，carR - SKOV3 细胞在高剂量卡铂处理 72 小时后，存活细胞数量显著减少，与 nonR - SKOV3 细胞相似，而未处理或转染非靶向 siRNA（siNC）的 carR - SKOV3 细胞变化不大。在细胞周期方面，高剂量卡铂处理后，nonR - SKOV3 细胞和 siABCB1 - carR - SKOV3 细胞 G2/M 期积累的细胞数量随时间增加，且倾向于停止细胞周期进程进行 DNA 修复或凋亡，而未处理或 siNC 转染的 carR - SKOV3 细胞 G2/M 期积累的细胞数量虽也增加，但梯度较低。通过检测 DNA 损伤诱导的 γ - H2AX 焦点形成和解离，发现 carR - SKOV3 细胞在未诱导 DNA 损伤时就有高水平的 γ - H2AX 焦点，且 72 小时恢复时间后仍有未解离的焦点，表明其 DNA 损伤未修复；ABCB1 抑制后，γ - H2AX 焦点水平显著降低，与 nonR - SKOV3 细胞相似。这些结果表明，G2/M 期积累的未修复细胞导致 p53^null卵巢癌细胞 DNA 修复活性减弱和耐药，ABCB1 抑制可逆转这一情况。
7. ABCB1 高表达与 p53^null突变的卵巢癌患者无进展生存期短和铂类药物耐药相关：研究人员分析 cBioPortal 和 COSMIC 数据库中人类浆液性卵巢癌样本数据，发现 67% 的卵巢癌患者存在 TP53 基因突变。在之前接受铂类药物治疗且 TP53 基因有截断或错义突变的卵巢癌患者中，ABCB1 基因表达水平与无进展生存期显著相关，ABCB1 高表达患者疾病复发时间更短。进一步分析发现，铂类药物敏感患者的无进展生存期明显长于耐药患者；在铂类药物耐药患者中，p53^null突变患者的中位无进展生存期短于 p53^missense突变患者；在铂类药物敏感患者中，p53^null突变患者的无进展生存期长于 p53^missense突变患者。这表明 ABCB1 基因表达状态对铂类药物耐药的卵巢癌患者影响更大，且在 p53^null突变患者中相关性更强。
   研究结论和讨论部分表明，本研究揭示了 p53^null的 SKOV3 细胞对卡铂产生耐药后，大量细胞积累在 G2/M 期，高表达干细胞标志物且具有增殖能力，抑制 ΔNp73 - ABCB1 轴可使这些细胞恢复到非耐药亲本细胞水平。ABCB1 抑制通过恢复 DNA 修复活性和降低干细胞样特征，使卡铂耐药细胞对额外基因毒性应激重新敏感，尤其是在 G2/M 期积累的细胞中。这意味着 G2/M 期积累细胞的高干细胞特性和低 DNA 修复活性可能是 p53^null卵巢癌更具侵袭性和耐药性的原因，而 p53^R248Q的 OVCAR3 细胞则无此现象。研究还指出 ABCB1 可能是 p53^null突变的卡铂耐药卵巢癌的有效分子靶点，针对它有望提高传统抗癌治疗效果，开发更有效的联合治疗方案，克服化疗耐药，提高卵巢癌患者生存率。这一研究成果为卵巢癌治疗开辟了新的道路，让我们在攻克卵巢癌的征程上又前进了一步，为众多卵巢癌患者带来了新的希望 。