雌激素对 DNMT3A 突变克隆性造血的性别差异影响：开启血液癌症防治新视角

《Cell Reports》：Sex differences in DNMT3A-mutant clonal hematopoiesis and the effects of estrogen

本文聚焦于 DNMT3A 突变克隆性造血（CHIP）性别差异。研究发现，DNMT3A 突变在女性中更常见，雌激素或有促进作用。通过人体和小鼠实验揭示相关机制，为深入理解血液癌症发病性别差异，探索新的防治策略提供重要依据。

　　### 研究背景
许多癌症的发病风险在男女之间存在显著差异，血液癌症也不例外，多数血液癌症男性发病率更高。然而，导致这些性别差异的生物学基础尚未完全明晰。在血液癌症相关的基因突变中，DNMT3A 是克隆性造血（CHIP）中最常发生突变的基因 ，其突变在女性中的流行率高于男性，不过，对于造成这种性别差异的环境因素以及性激素的作用，相关研究还较为缺乏。雌激素通过雌激素受体 α（ERα，由 Esr1 编码）和 β（ERβ，由 Esr2 编码）发挥作用，且造血干细胞和多能祖细胞高表达 Esr1，雌激素可诱导造血干细胞（HSCs）增殖。基于此，研究人员推测性激素可能影响造血过程，进而导致 DNMT3A 突变的性别差异，于是开展了本研究，旨在探究这一潜在关联。

DNMT3A 突变的 CHIP 在女性中更常见

为研究 CHIP 基因突变和染色体镶嵌改变（mCAs）的性别差异，研究人员分析了英国生物银行中 448,263 名参与者血细胞 DNA 的全外显子测序和单核苷酸多态性阵列强度数据。结果显示，多数 mCAs 在男性中更常见，但也有部分存在女性偏倚，如 5 号染色体长臂缺失，其在女性中的发生概率几乎是男性的两倍，这与骨髓增生异常综合征（MDS）患者中该改变的女性优势一致。在基因层面，DNMT3A 突变在女性中更为普遍，与大多数其他 CHIP 基因的男性偏倚分布不同，且这种性别偏倚与突变类型无关，在不同年龄段均存在。此外，研究人员分析雌激素水平和女性激素相关变量后发现，绝经后女性 DNMT3A 突变的流行率显著低于绝经前女性，这表明雌激素暴露可能与 DNMT3A 突变流行率有关。

雌性 Dnmt3a 突变的 HSCs 自我更新基因表达改变

为探究影响雌性 Dnmt3a 突变血细胞功能改变的基因或通路，研究人员对带有或不带有条件表达 Dnmt3a^R878H突变（小鼠中与 DNMT3A^R882热点突变类似）的雄性和雌性小鼠进行了造血干细胞和祖细胞（HSPC）基因表达分析。通过单细胞 RNA 测序（RNA-seq），研究人员鉴定出 19 个细胞簇，对应不同造血细胞类型。分析发现，在 HSPC 簇中，Dnmt3a 突变细胞的性别差异比野生型（WT）细胞更为明显。雌性 Dnmt3a 突变的 HSCs 中，与 HSC 自我更新和干性相关的基因（如 Tcf15、Socs2 和 Hoxa5）表达增加，同时 DNA 修复和内质网应激反应基因表达也有所上升。在造血祖细胞（HPC）和更分化的细胞类型中，雌性 Dnmt3a 突变细胞中参与应激调节通路的基因表达也增加。通过流式细胞术评估 HSC 频率发现，Dnmt3a 突变小鼠的长期 HSC（LT-HSCs）相对频率高于 WT 小鼠，而雌性小鼠的短期 HSC（ST-HSCs）频率低于雄性小鼠。这些结果表明，Dnmt3a 突变对干细胞维持相关的转录影响在雌性中更为显著，且基因型和性别相关的基因表达变化反映在 HSC 群体的相对流行率上。

AP-1 转录因子在 Dnmt3a 突变的 HSCs 中比 WT HSCs 更活跃

为研究 WT 和 Dnmt3a 突变的 HSCs 之间染色质可及性差异以及可能影响基因表达变化的转录因子结合基序，研究人员对未处理的雌性 WT 和 Dnmt3a 突变小鼠的 LSK 细胞进行了单细胞转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）。结果显示，Dnmt3a 突变的 HSCs 中多数差异可及染色质区域的 ATAC-seq 信号更强，这些区域靠近 Hoxa5 等基因，与雌性 Dnmt3a 突变的 HSCs 中该基因表达增加一致。通路富集分析表明，雌激素反应通路是主要富集通路。通过 chromVAR 分析，研究人员发现与 AP-1 转录因子复合物成员相关的基序在 Dnmt3a 突变的 HSCs 中比 WT HSCs 中更活跃，转录因子足迹分析也证实了这一点。此外，利用 SCENIC 从单细胞 RNA-seq 数据中鉴定转录因子及其靶基因，发现 AP-1（Jun 和 Fos）组转录因子在 HSCs 差异表达基因中富集。这些结果表明，AP-1 转录因子调节性别和基因型特异性基因表达，尤其影响雌性 Dnmt3a 突变小鼠中与 HSC 自我更新增加相关的基因表达变化。

急性雌激素处理对 Dnmt3a 突变髓系祖细胞应激反应基因表达的影响

雌激素会改变 HSCs 的自我更新和增殖，但对携带 CHIP 突变的 HSCs 的选择压力尚未明确。研究人员利用卵巢切除的小鼠作为骨髓移植受体，构建了缺乏内源性雌激素的小鼠模型。将雌性 WT 或 Dnmt3a 突变细胞移植到卵巢切除的小鼠中，然后用雌激素（雌二醇）或雄激素（5α- 二氢睾酮，DHT）处理。对处理后的小鼠进行单细胞 RNA-seq 分析发现，Dnmt3a 基因型和雌二醇处理均影响 HSC、HSPC 和祖细胞簇的转录谱。与 WT HSCs 相比，Dnmt3a 突变的 HSCs 中与免疫反应和分化相关的基因表达降低，而与髓系细胞稳态相关的基因表达增加。预测结果显示，ESR1 和参与 DNA 复制与修复的复制蛋白 A（RPA）是与 Dnmt3a 突变的 HSCs 中高表达基因调控相关的主要转录因子。雌二醇对 HSC 和 HSPC 基因表达的影响强于 DHT，且在髓系祖细胞中，雌二醇以基因型特异性方式增加应激反应基因的表达，这与未处理雌性小鼠单细胞数据中 Dnmt3a 突变的 HSPCs 中这些应激调节通路活性增加一致。此外，血液计数分析和免疫表型分析表明，雌激素处理后，Dnmt3a 突变血细胞的小鼠白细胞和血小板水平增加，骨髓中 HSC 和未成熟祖细胞群体的相对频率降低。这些结果表明，ESR1 转录活性参与调节与 Dnmt3a 突变的 HSCs 适应性增加相关的基因集，且 Dnmt3a 突变的髓系细胞在暴露于雌二醇时激活应激反应，可能平衡急性雌激素暴露的增殖压力。

长期、高剂量雌激素导致骨髓 HSCs 耗竭

研究人员测试了不同剂量急性雌激素暴露对 HSC 频率和增殖的影响。将雌性 WT 或 Dnmt3a 突变的骨髓细胞移植到卵巢切除的小鼠中，6 周后用单剂量雌二醇或载体处理。结果显示，雌二醇处理后，Dnmt3a 突变细胞移植小鼠的 HSC 亚群和多能祖细胞 2（MPP2）群体频率变化不如 WT 细胞移植小鼠明显，而 MPP3 和髓系祖细胞群体频率变化更显著。此外，WT LT-HSCs 和 MPP2 在中等剂量雌二醇处理后增殖增加，而 Dnmt3a 突变的 LT-HSCs 和多能祖细胞增殖变化较小，表明 Dnmt3a 突变的 HSCs 处于更静止的状态。研究人员进一步研究长期、高剂量雌激素对造血的影响，将雌性 WT 细胞移植到卵巢切除的小鼠中，用雌二醇、DHT 或安慰剂处理 12 周。结果发现，雌二醇处理显著降低骨髓细胞数量，增加骨形成，导致血小板减少，引发骨髓衰竭。对接受短期或长期雌二醇处理小鼠的血常规分析发现，长期雌激素处理影响所有血细胞谱系，且导致的血液细胞变化与人类血液计数的性别差异高度一致。研究人员还测试了 Esr1 基因敲除对 WT 和 Dnmt3a 突变细胞的影响，发现 Esr1 基因敲除减少髓系细胞频率，增加 B 细胞频率，且对 Dnmt3a 突变供体细胞的髓系细胞频率影响更大。综上所述，雌激素处理对 HSC 增殖具有剂量依赖性影响，最终导致骨髓衰竭和所有成熟血细胞群体的消耗，且雌激素诱导的 LT-HSCs 增殖在 Dnmt3a 突变存在时减弱，这可能保护 Dnmt3a 突变的 HSCs 免受雌激素增殖压力导致的耗竭。

雌激素促进 Dnmt3a 突变髓系细胞的扩增

在竞争性移植模型中，研究人员将卵巢切除的小鼠移植 1:4 混合的雌性 Dnmt3a 突变和 WT 骨髓细胞，评估雌激素对 Dnmt3a 突变和 WT 造血细胞的相对影响。移植 4 周后评估供体细胞植入情况，然后用雌二醇或载体处理 10 周。结果显示，虽然 Dnmt3a 突变供体细胞的植入在不同处理组中相似，但雌二醇处理显著促进了 Dnmt3a 突变髓系细胞的扩增，而在 B 和 T 细胞区室中，Dnmt3a 突变供体细胞的扩增不受激素条件影响（除雌激素处理初期 B 细胞短暂减少外）。在骨髓中，Dnmt3a 突变供体细胞比 WT 细胞扩增更多，雌激素处理增加了 Dnmt3a 突变细胞在髓系祖细胞区室的适应性，尤其在粒细胞 - 巨噬细胞祖细胞（GMP）和巨核细胞 - 红细胞祖细胞（MEP）区室。这些结果表明，雌激素使 Dnmt3a 突变髓系细胞相对于 WT 细胞获得竞争优势，差异影响正常和 Dnmt3a 突变血细胞的适应性。

Esr1 基因敲除抑制雌激素处理后 Dnmt3a 突变髓系细胞的扩增

为证实雌二醇对 Dnmt3a 突变血细胞的影响是由 ERα 直接介导，而非细胞非自主效应，研究人员进行了 Esr1 基因敲除细胞的竞争性骨髓移植。将雌性 Esr1 基因敲除的 Dnmt3a 突变 CD45.2⁺供体细胞和 Esr1 基因敲除的 Dnmt3a WT CD45.1/2⁺竞争细胞以 1:4 的比例移植到卵巢切除的小鼠中，然后用雌二醇或载体处理。结果显示，不同处理组中 CD45.2 供体细胞的植入以及供体细胞中髓系、B 和 T 细胞比例的变化相似，Esr1 基因敲除的 Dnmt3a 突变细胞在雌激素处理后，在髓系区室没有竞争优势，甚至处于竞争劣势，在骨髓中对不同 HSPC 区室的贡献在不同处理组中也相似。这些结果表明，Dnmt3a 突变血细胞在雌激素处理后的竞争优势依赖于 ERα 活性。

研究结论与展望

本研究通过对英国生物银行数据的分析以及小鼠模型实验，发现 DNMT3A 基因突变和缺失在人类克隆性造血中女性比男性更常见。在小鼠模型中，雌性 Dnmt3a 突变的 HSCs 相较于雄性和 WT HSCs，干性基因表达增加。Dnmt3a 突变的 HSCs 在急性雌激素处理下增殖少于 WT HSCs，但在长期雌激素暴露下能胜过 WT 细胞，且表达更高水平的应激反应基因。这种竞争优势依赖于造血细胞中 Esr1 的表达，在髓系谱系中最为明显。研究还发现，雌激素处理对 HSC 增殖具有剂量依赖性影响，长期高剂量处理会导致骨髓衰竭。虽然本研究提示雌激素可能导致 DNMT3A 突变的女性偏倚，但目前的小鼠模型存在局限性，如小鼠和人类 Dnmt3a 突变细胞甲基化差异、无法模拟间接性染色体效应和促性腺激素的影响，以及与人类雌激素水平周期性变化的差异等。此外，研究未能明确雌激素水平与女性 DNMT3A 突变克隆性造血优势之间的机制联系，也未提供雌激素水平与人类女性 DNMT3A 突变 CHIP 流行率或生长相关性的直接证据。因此，未来需要进一步研究雌激素水平和终生雌激素暴露对人类 DNMT3A 突变克隆性造血的影响，这可能为血液癌症的预防和干预提供新策略。