揭秘 FoxP3：在微卫星上构建超稳定多功能聚合体，重塑免疫调控新格局

《Molecular Cell》：Ultrastable and versatile multimeric ensembles of FoxP3 on microsatellites

本文聚焦 FoxP3 与微卫星的相互作用，通过冷冻电镜和单分子分析发现，FoxP3 能识别多种 TnG 重复微卫星，形成不同超分子组装体，且其多聚体超稳定。核小体可促进其组装，该研究为理解转录调控和相关疾病机制提供重要依据。

　　

研究背景

微卫星（microsatellites）作为基因组的重要组成部分，约占人类基因组的 5%。传统观点认为其是具有高突变性的偶然遗传成分，会导致个体间遗传变异，在某些情况下还会因破坏现有遗传元件而引发疾病。然而，越来越多的证据表明，微卫星在转录调控中发挥着直接且积极的作用。许多微卫星在基因近端的顺式调控元件中进化富集，约 90% 测试过的转录因子（transcription factors，TFs），尤其是带有叉头 DNA 结合域（DBD）的转录因子，都能在体内和体外结合特定微卫星以实现转录功能。但转录因子识别微卫星的机制在很大程度上仍不清楚。

FoxP3 是调节性 T 细胞（regulatory T cell，Treg）发育和功能的核心转录因子，对维持免疫稳态至关重要。Treg 细胞功能异常会引发多种自身免疫性疾病，而 FoxP3 的功能缺失突变或敲除会导致人类和小鼠出现严重的自身免疫问题。起初，人们认为 FoxP3 识别叉头共识基序 TGTTTAC（FKHM），后来发现它更倾向于结合反向重复的 FKHM（IR - FKHM）序列并形成头对头二聚体。但这些序列并非 Tregs 中 FoxP3 的主要基因组靶点。近期研究表明，TnG 重复微卫星（n = 2 - 5，总长度约 30 - 100 碱基对）才是 FoxP3 基因组结合的主要驱动因素，FoxP3 与这些序列具有高亲和力。此前的冷冻电镜（cryo - EM）结构显示，FoxP3 在 T3G 重复 DNA 上可形成多聚体组装体，不仅能稳定染色质环，还揭示了其新的建筑功能。不过，这也引发了新问题，如当 DNA 序列变化时，这种 DNA 支架多聚体结构如何适应，以及核小体在其中的作用等。

FoxP3 与 T4G 重复 DNA 复合物的结构

为探究 FoxP3 如何结合 T4G 重复 DNA，研究人员测定了 FoxP3 与 (T₄G)₁₅ DNA 复合物的冷冻电镜结构。实验使用了去除 N 端无序区域的 FoxP3（FoxP3^ΔN），它与全长蛋白具有相同的 DNA 序列特异性。通过负染色 EM 和冷冻电镜分析，发现该复合物存在多聚体结构，冷冻电镜 3D 重建鉴定出三个不同类别：两个含有两个 DNA 拷贝的类别和一个含有三个 DNA 拷贝的类别。

在所有三种复合物结构中，每个 T4G DNA 都直接与三到四个 FoxP3 分子结合，这些 FoxP3 分子进一步相互作用，连接不同的 DNA 分子。与 T3G 重复上的 FoxP3 多聚体相比，T4G 重复的多聚体结构明显不同，T3G 重复的多聚体呈现对称桥接两个 DNA 拷贝的结构。通过分析 FoxP3 亚基与 DNA 的相互作用发现，T4G 重复中，FoxP3 亚基以相同方式结合每个 DNA，识别 TGTTTTG 序列，间隔 10bp，这种排列使 FoxP3 分子在 DNA 一侧排列，诱导 DNA 向内弯曲约 20°，并阻止其结合另一侧未占据的 TGTTTTG 位点。而在 T3G 重复中，FoxP3 识别 TGTTTGT 序列，间隔为 8 和 12bp 交替，且仅在 8bp 间隔时存在 DNA 内相互作用。此外，T4G 重复的 DNA 桥接机制也与 T3G 重复不同，T4G 重复存在至少两种不同的桥接方式，即反平行和平行，且蛋白质 - 蛋白质相互作用也不同。

FoxP3 与 T2G 重复 DNA 复合物的结构

研究人员还测定了 FoxP3 与 (T₂G)₂₄ DNA 复合物的冷冻电镜结构。负染色 EM 和冷冻电镜图像显示，T2G 复合物的颗粒比 T3G 和 T4G 复合物更大，这与电泳迁移率变动分析（EMSA）和尺寸排阻色谱的结果一致。冷冻电镜重建揭示了该复合物的两个类别：一个主要类别（93%）包含约 28 个 FoxP3 拷贝和 4 个 DNA 拷贝，呈桶状结构；一个次要类别（7%）大小为主要类别的一半。

在 T2G 重复中，FoxP3 亚基以相同方式结合每个 DNA，识别 TGTTGTT 序列，间隔 6bp，相邻 FoxP3 亚基位于 DNA 的相对两侧，因此未观察到明显的 DNA 内接触，T2G 重复 DNA 也几乎没有弯曲。为补偿 DNA 内相互作用的缺乏，T2G 复合物存在广泛的 DNA 间相互作用，由 FoxP3 蛋白介导，有两种 DNA 桥接模式，且两种模式的蛋白质 - 蛋白质相互作用不同。主要类别的复合物可能通过先形成模式 1 相互作用，再形成模式 2 相互作用逐步形成，这再次表明微卫星重复序列的微小差异会改变亚基间相互作用和整体组装结构。

FoxP3 形成不同组装结构的机制

通过比较 FoxP3 在不同 DNA 序列（T2G、T3G、T4G 重复 DNA 以及 IR - FKHM）上的多聚体中 FoxP3 - FoxP3 相互作用，研究人员发现共存在 12 种不同的成对相互作用。FoxP3 利用其广泛的表面区域进行亚基间相互作用，不同复合物中参与蛋白质 - 蛋白质相互作用的残基不同，但 RBR（Runx1 结合区域）在所有复合物中都起着核心作用。

RBR 具有独特的构象变化能力，能根据不同的复合物和相互作用亚基的间距及方向采取不同的构象。其高疏水性和表面暴露芳香族残基的高密度，使其能够折叠成多种构象并与不同表面相互作用。对 RBR 关键芳香族残基的突变会损害 FoxP3 在所有测试 DNA 序列上的多聚化，并破坏其在 CD4 T 细胞转导实验中的细胞功能。这表明 RBR 的内在构象变化能力和疏水性使 FoxP3 能够根据特定 DNA 序列形成多样的多聚体组装体。

FoxP3 多聚体的超稳定性

研究中观察到 FoxP3 多聚体结构中 DNA 拷贝数存在异质性，这引发了关于是否存在未被捕获的组装状态以及各组装结构稳定性的问题。为解决这些问题，研究人员采用单分子分析方法。

他们使用 “双节棍”（nunchuck）构建体进行单分子荧光共振能量转移（FRET）实验，该构建体包含两个相同 TnG 重复序列的 dsDNA 区域，中间由 18 原子的六乙二醇间隔物连接，并分别标记 Cy3（FRET 供体）和 Cy5（FRET 受体）。实验结果表明，FoxP3 能与所有三种 TnG（n = 2 - 4）重复序列形成超稳定的双 DNA 复合物，且该复合物在洗涤后 FRET 信号仍保持稳定，而突变 RBR 或改变其中一个臂的序列为随机序列时，FRET 增加不明显或信号不稳定。此外，研究还发现 FoxP3 结合和桥接 T3G 重复的效率更高，T2G 和 T4G 可能需要最大程度的 DNA 重叠才能实现稳定结合。

通过监测折叠的 “双节棍” 构建体招募单独的 Cy7 标记 DNA 的能力，研究人员发现 FoxP3 能够桥接多于两个的 DNA 拷贝，形成三向或四向 DNA 桥接。单分子下拉实验进一步量化了 FoxP3 多聚体中的 DNA 拷贝数，结果表明在 FoxP3 存在的情况下，约 50% - 60% 的荧光点包含两个或更多 DNA 分子，其中 T2G 重复形成四 DNA 复合物的倾向最高。这些结果证明了 FoxP3 多聚体在不同 DNA 拷贝数下的显著异质性和稳定性。

核小体对 FoxP3 桥接 TnG 重复能力的影响

单分子分析表明 FoxP3 介导的 DNA 桥接可在局部和远处发生，且 DNA 弯曲可能在局部 DNA 桥接中起作用。研究人员推测核小体等 DNA 弯曲蛋白可能促进 FoxP3 诱导附近 TnG 重复的局部桥接。

分析 FoxP3 CUT&RUN（CNR）峰内的 TnG 重复发现，TnG 重复在 FoxP3 结合区域更密集地聚集，且常位于可及开放染色质区域（OCRs）的边缘，其可及性低于 OCR 峰，但高于 FoxP3 CNR 峰外的 TnG 重复。这表明核小体可能在 FoxP3 结合中发挥作用。

实验中，研究人员使用含核小体定位序列（601）且两侧为 T3G 重复的 DNA，发现 FoxP3 更倾向于结合核小体 DNA。负染色 EM 显示，FoxP3 与核小体 DNA 复合物形成了独特的结构，且在核小体存在的情况下，FoxP3 复合物在 TnG - TnG DNA 上的聚集更多。此外，核小体 DNA 能够增强 FoxP3 与单独的 Cy5 - TnG DNA 的结合，表明核小体在顺式和反式中都能正向影响 FoxP3 多聚化。在细胞实验中，通过双荧光素酶报告基因实验也证实了核小体侧翼的 T3G 重复能进一步增强 FoxP3 介导的增强子 - 启动子桥接。

研究讨论

蛋白质同多聚化在转录中的作用正逐渐被揭示，而 DNA 支架的 TF 多聚化受 DNA 序列影响。本研究发现 FoxP3 通过结构可塑性来识别和适应不同的 TnG 重复微卫星，其 RBR 区域的构象变化和广泛的蛋白质 - 蛋白质相互作用表面使 FoxP3 能够形成多种不同的超分子组装体。

FoxP3 的架构多功能性体现在其多向 DNA 桥接能力上，它不仅能桥接两个 DNA 双链，还能桥接三个或四个，这一过程可能涉及分层组装，有助于稳定染色质环，在转录调控中发挥重要作用。此外，研究还发现 FoxP3 可利用核小体增强其 DNA 靶标的识别，尽管目前尚未确定基因组中两个 TnG 重复侧翼有明确核小体信号的位点，但核小体的动态定位可能足以促进 FoxP3 结合，这揭示了核小体与非先锋转录因子之间一种未被认识的相互作用模式。

研究局限性

尽管体外研究证明了 FoxP3 通过合作多聚体组装桥接多个 DNA 双链的能力，但目前的染色质构象分析工具，如高通量染色体构象捕获测序（Hi - C）、Hi - C 染色质免疫沉淀（Hi - ChIP）和邻近连接辅助染色质免疫沉淀测序（PLAC - seq），难以在体内获得此类多向桥接的证据。同时，虽然研究表明核小体在 TnG 重复侧翼可促进 FoxP3 结合，但在天然基因组靶位点的直接证据仍有待进一步研究，且连接组蛋白 H1 在这一过程中的潜在作用也需进一步探讨。此外，由于全长 FoxP3 纯化困难，本研究使用了 FoxP3^ΔN，其 N 端区域的功能贡献尚待未来研究探索。