兔出血性疾病病毒GI.2型中和抗体的表位定位及其病毒中和机制研究

《Veterinary Research》：Epitope mapping of a neutralizing antibody against rabbit hemorrhagic disease virus GI.2

为解决RHDV GI.2型变异株对幼兔致病性强且现有疫苗保护不足的问题，西班牙奥维耶多大学团队通过表位定位技术，发现单克隆抗体2D9通过识别VP60蛋白P2亚结构域的外环区（L1/L4/L5）形成不连续中和表位，动物实验证实其可完全阻断病毒感染。该研究为开发新型抗病毒制剂提供了关键靶点，成果发表于《Veterinary Research》。

　　

兔出血性疾病（Rabbit hemorrhagic disease, RHD）是由兔出血性疾病病毒（RHDV）引起的高度传染性致死性疾病，对欧洲家兔（Oryctolagus cuniculus）养殖业造成严重威胁。作为杯状病毒科（Caliciviridae）成员，RHDV存在GI.1和GI.2两种主要基因型，其中2010年出现的GI.2型变异株展现出独特致病特性——不仅能感染成年兔，还可导致40日龄以下幼兔死亡，且现有GI.1型疫苗对其保护有限。更棘手的是，GI.2型在全球范围迅速传播，已在澳大利亚和伊比利亚半岛取代传统GI.1型成为优势毒株。面对这一严峻形势，西班牙奥维耶多大学生物技术研究所团队聚焦于病毒关键抗原——衣壳蛋白VP60（又称VP1），试图破解其中和机制以指导新型防控策略开发。

研究团队选择具有诊断价值的GI.2特异性单克隆抗体2D9作为突破口。前期研究发现该抗体能区分GI.1与GI.2毒株，但其精确作用靶点及中和机制尚未阐明。为此，研究人员综合运用结构生物学、免疫学与病毒学方法，系统解析了2D9抗体的表位特征与功能意义，相关成果发表在《Veterinary Research》期刊。

关键技术方法包括：1）通过杆状病毒表达系统制备RHDV GI.1/GI.2病毒样颗粒（VLP）及VP60分段蛋白；2）采用表面等离子共振（SPR）定量分析2D9与VLP的亲和力；3）构建P2亚结构域环区置换突变体（L1-L5），通过ELISA评估表位关键区域；4）基于自然流行株逃逸突变特征设计点突变体（N387D/A等）；5）开展动物攻毒实验验证中和效果（使用西班牙农场分离株RHDV-Gal08/13）。

研究结果首先通过免疫印迹技术明确了2D9抗体的特异性。dot blot显示该抗体仅识别GI.2型完整VLP及全长P结构域（aa230-569），而对单独表达的P1/P2亚结构域无反应，提示其识别构象表位。SPR分析揭示2D9与GI.2 VLP具有高亲和力（K_d=9±2 nM），符合中和抗体的结合特性。为精确定位表位，团队创新性地采用"环置换"策略——将GI.2 P结构域中五个表面暴露环（L1-L5）分别替换为GI.1b型对应序列。ELISA数据表明，单个环置换均降低结合活性，其中L5置换使结合率骤降至2%，而L1+L4+L5三联置换仅保留2.68%活性，证实这些环区共同构成不连续表位。

研究还发现自然界存在2D9逃逸突变株。对西班牙两起疫情分离株测序发现，L4区N387D突变可完全消除抗体结合，而N387A突变保留64%活性，说明该位点电荷特性对表位构象至关重要。更令人振奋的是，动物实验证实2D9具有完全保护作用：用该抗体预处理的GI.2病毒接种兔子后，实验组全部存活且无临床症状，而对照抗体3A10处理组48小时内全部死亡。

讨论部分指出，该研究首次阐明GI.2型特异性中和抗体的作用机制。VP60蛋白P2亚结构域外环区（尤其L1/L4/L5）形成的复杂空间构象是2D9识别的关键，这一发现与近期冷冻电镜结构研究（PDB 9JJJ）相互印证。值得注意的是，自然流行株中发现的逃逸突变（如N387D）提示病毒正通过抗原漂移逃避宿主免疫压力，这对疫苗设计具有警示意义。从应用角度看，2D9表位信息为开发广谱疫苗提供了新靶点，其强中和能力则展现出治疗性抗体开发潜力。此外，研究建立的环区置换技术为其他杯状病毒表位研究提供了方法学参考。

这项工作的科学价值还体现在三方面：1）揭示了GI.2与GI.1的抗原差异结构基础；2）证实P2区外环在病毒中和中的核心作用；3）为理解RHDV免疫逃逸进化提供了分子证据。随着类器官培养技术的突破，未来可在体外模型中进一步验证2D9阻断病毒附着血型抗原（HBGA）的具体机制，推动抗病毒药物研发。