基于重组酶聚合酶扩增结合 SYBR Green I 的牛病毒性腹泻病毒快速可视化检测技术的研究

为解决牛病毒性腹泻病毒（BVDV）检测方法存在的耗时、昂贵等问题，研究人员开展 BVDV 的重组酶聚合酶扩增结合 SYBR Green I（RPAS）检测技术研究。结果显示该方法灵敏度高、特异性强，对防控牛病毒性腹泻意义重大。

　　牛，作为畜牧业的重要支柱，为人类提供了丰富的肉、奶等产品。然而，有一种 “隐藏的杀手” 时刻威胁着牛群的健康，那就是牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）。BVDV 能引发牛病毒性腹泻（BVD），这可不是简单的小毛病，被感染的牛会出现发热、腹泻、溃疡甚至流产等症状，给全球的养牛业带来了巨额的经济损失。

目前，BVDV 的检测方法五花八门，却都存在一些 “硬伤”。病毒分离法，需要活病毒来确定阳性结果，不仅耗时久，而且病毒分离难度大；像 PCR 技术这类分子生物学检测方法，要么耗时、成本高，要么对实验室设备和操作人员的要求极高；血清学方法则依赖高质量的抗血清，成本也不低。在这样的背景下，开发一种高效、快速且灵敏，还能适用于现场检测的方法迫在眉睫。

宁夏大学的研究人员勇挑重担，开展了关于 BVDV 的重组酶聚合酶扩增结合 SYBR Green I（RPAS）检测技术的研究。他们的研究成果意义非凡，建立的 BVDV RPAS 检测方法，特异性强、灵敏度高，能在 37°C、25 分钟内完成检测，操作简单，不需要昂贵的大型仪器，为牛病毒性腹泻的防控提供了有力的新工具，相关研究成果发表在《BMC Veterinary Research》上。

研究人员在开展研究时，主要运用了以下关键技术方法：首先是重组酶聚合酶扩增（RPA）技术，这是一种新型的核酸扩增技术，反应温度低、时间短、操作简便；其次，通过在反应体系中加入 SYBR Green I，实现了对扩增产物的可视化检测；研究还使用了临床样本检测，包括牛的鼻拭子、肛拭子和血清样本，以评估该检测方法的实际应用效果。

研究结果如下：

• 构建和鉴定重组质粒：将 BVDV 的 5’UTR 基因构建到 pcDNA 3.1 载体上，得到重组质粒 pcDNA 3.1-BVDV。经酶切和测序验证，结果符合预期。
• 优化反应条件：通过筛选不同的引物和测试不同的反应温度、时间，确定了 BVDV RPA 检测的最佳引物为 5’UTR-1 F/R，最佳反应温度为 37°C，最佳反应时间为 25 分钟，且该检测方法重复性良好。
• 评估灵敏度和特异性：在日光下，BVDV RPAS 的最低检测限为 1×10³ copies/μL ，在紫外光下为 1×10¹ copies/μL，其检测限远高于 BVDV PCR。同时，该检测方法对其他牛呼吸道和腹泻相关病毒无交叉反应，特异性高。
• 临床样本验证：对牛鼻拭子、肛拭子和血清样本的检测结果显示，BVDV RPAS 检测的阳性率高于 PCR，表明该方法在临床样本检测中具有可行性。

研究结论和讨论部分指出，BVDV 是危害牛群健康的重要病原体，BVDV RPAS 检测方法能在短时间内完成检测，且具有诸多优势。尽管该方法存在一些局限性，如成本较高、可能出现假阳性等，但通过优化反应体系、采用低成本的核酸提取方法等措施，有望进一步完善。总体而言，BVDV RPAS 检测方法为资源有限的实验室或现场检测提供了一种潜在的解决方案，对牛病毒性腹泻的防控意义重大。