CRISPR/Cas12a 系统联合等温扩增技术：快速可视化检测猪传染性胃肠炎病毒的新突破

《BMC Veterinary Research》：Rapid and visual detection of transmissible gastroenteritis virus using a CRISPR/Cas12a system combined with loop-mediated isothermal amplification

为解决传统猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）检测技术复杂、需专业工具且耗时久的问题，研究人员开展了利用 CRISPR/Cas12a 系统结合环介导等温扩增（LAMP）技术检测 TGEV 的研究。结果成功建立了相关检测方法，灵敏度高且无交叉反应，为 TGEV 防控提供了新途径。

　　猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis，TGE）是一种严重威胁养猪业的高度传染性肠道疾病，罪魁祸首是猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）。感染 TGEV 的猪，尤其是仔猪，会出现急性胃肠道症状，像抑郁、水样腹泻、严重呕吐等，死亡率颇高，给全球养猪产业带来了巨大的经济损失。而且，TGEV 还存在跨物种传播的风险，这无疑让情况雪上加霜。

目前，用于检测 TGEV 的主要技术，如酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和荧光定量 PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）等，都存在一些明显的缺陷。ELISA 检测耗时长，灵敏度较低，还容易出现假阳性结果；PCR 和 qPCR 虽然灵敏度高，但需要专业的设备，操作过程繁琐，并不适合在猪场等现场检测场景中使用。所以，开发一种精准、快速又高效的 TGEV 鉴别诊断方法迫在眉睫。

为了攻克这一难题，安徽农业大学动物科技学院的研究人员展开了深入研究。他们将目光聚焦于近年来备受关注的成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）和 Cas 相关蛋白技术。最终，研究人员成功建立了基于 CRISPR-Cas12a 的荧光检测法和侧向流动试纸条检测法，用于临床 TGEV 的检测。这一成果意义重大，为 TGEV 的防控提供了更便捷、高效的检测手段，有助于养猪业及时发现和控制疫情，减少经济损失。相关研究成果发表在《BMC Veterinary Research》上。

研究人员在研究过程中，主要运用了以下关键技术方法：一是针对 TGEV 的保守 N 基因设计了特异性的 crRNA 和引物。二是利用环介导等温扩增（LAMP）技术对目标基因进行扩增，该技术能在等温条件下高效扩增核酸。三是基于 LAMP 扩增产物，构建了 CRISPR-Cas12a 荧光检测体系和侧向流动试纸条检测体系。实验样本来源于安徽猪场疑似感染 TGEV 的猪粪便，经 RT-PCR 鉴定为阳性。

下面来详细看看研究结果：

1. 评估最佳 crRNA：转录纯化后的 crRNA 用于 CRISPR-Cas12a 荧光检测实验，反应结束后在紫外光下观察。结果显示，三组 crRNA 都呈现出明显的绿色荧光。通过荧光 PCR 定量和 GraphPad Prism 8 软件分析，发现第一组 crRNA 的荧光信号值最高，肉眼观察结果也更清晰，因此被选用于后续实验。
2. 建立 LAMP 系统并评估其灵敏度：研究人员设计了六对 LAMP 引物，分两组进行检测。经琼脂糖凝胶电泳分析，发现第二组引物的扩增效果最佳。进一步对扩增产物进行检测，确定 LAMP 检测方法的灵敏度为 102 copies/μL ，不过该方法实验操作繁琐，且需要昂贵的设备。
3. 建立并优化 CRISPR-Cas12a 荧光检测法：在不同反应时间和温度条件下进行实验，结果表明，反应温度为 37°C 时，荧光值在 30 分钟后趋于稳定；综合荧光信号强度，确定最佳检测条件为 39°C 扩增 30 分钟。在此条件下，以重组质粒 pCIneo-N 为模板进行 10 倍梯度稀释检测，该荧光检测法的灵敏度可达 10? copies/μL 。
4. 评估 CRISPR-Cas12a 荧光检测法的特异性：以 LAMP 扩增的 pCI-neo-N 为模板，在最佳 CRISPR-Cas12a 扩增条件下进行实验。结果显示，只有 TGEV 组出现绿色荧光，证明该检测法与猪圆环病毒 2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）、猪圆环病毒 3 型（Porcine circovirus type 3，PCV3）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、猪圆环样病毒（Porcine circovirus-like virus，PCLV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）和猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）等均无交叉反应。
5. 建立并优化 CRISPR/Cas12a 侧向流动试纸条检测法：为了提高 TGEV 检测的便捷性和速度，在 CRISPR-Cas12a 荧光检测法的基础上开发了侧向流动试纸条检测法。通过调整探针浓度进行优化，确定最终探针浓度为 150 nM 时可消除假阳性，综合考虑成本效益和 crRNA 切割效率，选择 30 nM 作为最佳探针浓度。
6. 评估 CRISPR/Cas12a 侧向流动试纸条检测法的灵敏度和特异性：以重组质粒 pCIneo-N 为模板进行 LAMP 扩增，该试纸条检测法的最低检测限为 102 copies/μL 。同时，以 LAMP 扩增的 pCI-neo-N 为模板，与其他相关病毒同时检测，未发现交叉反应。
7. 评估两种检测方法对临床样本的检测性能：使用建立的 CRISPR-Cas12a 荧光检测法、CRISPR/Cas12a 侧向流动试纸条检测法和 RT-PCR 法对 13 份临床样本进行检测。结果显示，前两种检测方法的检测结果均为阳性，且与 RT-PCR 数据的符合率达到 100%，表明这两种检测方法适用于临床检测等应用场景。

在讨论部分，研究人员指出，TGEV 给养猪业带来了严重危害，早期准确检测对控制其传播至关重要。CRISPR-Cas 系统的出现为病毒检测提供了新的思路和方法，与其他技术相结合能够快速、灵敏地检测多种病原体。本研究建立的两种 TGEV 检测方法，具有高效、快速、灵敏且特异性强的特点。不过，CRISPR-Cas12a 荧光检测法需要特定设备观察结果，且肉眼观察与仪器测量存在差异；CRISPR/Cas12a 侧向流动试纸条检测法的反应条件还可进一步优化。总体而言，CRISPR/Cas12a 检测法结合 LAMP 扩增技术和侧向流动试纸条，简化了 TGEV 检测设备，使其更经济、易用，为养猪业 TGEV 的防控提供了有力支持。