一种用于布鲁氏菌 S2 疫苗株差异检测的 qPCR 方法的建立及应用：解决临床检测难题，助力疫病防控

《BMC Veterinary Research》：Establishment and application of a qPCR method for differential detection of Brucella S2 vaccine strain

为解决布鲁氏菌病（Brucellosis）疫苗免疫抗体与自然感染抗体难以区分、疫苗株和自然强毒株鉴别困难的问题，研究人员开展了布鲁氏菌 S2 疫苗株差异诊断方法的研究。成功建立了 duplex qPCR 检测方法，该方法特异性、敏感性和重复性良好，可用于临床布鲁氏菌病的鉴别诊断，为疫病防控提供技术支持。

　　布鲁氏菌病是一种严重危害人类和家畜健康的全球性人畜共患病，它就像一个隐藏在暗处的 “健康杀手”，悄无声息地给畜牧业带来巨大损失。目前，疫苗免疫是防控布鲁氏菌病的主要手段，但常用的疫苗接种后，却缺乏能区分疫苗免疫抗体和自然感染抗体的有效方法，这使得检疫和净化工作举步维艰。而且，在布鲁氏菌自然强毒株和疫苗株的鉴别诊断方面，相关研究也较为匮乏。因此，建立一种快速、灵敏且准确的布鲁氏菌 S2 疫苗株鉴别诊断方法迫在眉睫，这对于减少养殖场经济损失、保障公共卫生安全具有重要意义。

内蒙古农业大学等机构的研究人员积极投身于这项研究。他们致力于建立一种用于布鲁氏菌 S2 疫苗株差异检测的方法，经过一系列实验探究，最终成功建立了基于 TaqMan 探针的双重定量聚合酶链反应（duplex qPCR）检测方法。这一成果意义非凡，它为临床布鲁氏菌病的鉴别诊断提供了有力工具，有效解决了生产实践中布鲁氏菌病鉴别诊断方法缺失的技术难题，为疫病的净化和防控提供了关键的技术支持。该研究成果发表在《BMC Veterinary Research》杂志上。

研究人员在研究过程中用到了多个关键技术方法。首先，通过 SnapGene 软件对比布鲁氏菌 S2 疫苗株和自然强毒株的全基因组序列，筛选出差异片段，以此为基础设计引物和探针。接着，运用 TaqMan 探针 qPCR 技术，构建重组质粒标准品，优化反应条件并建立标准曲线。同时，开展特异性、敏感性和重复性实验，评估检测方法的性能。此外，利用建立的方法对临床样本进行检测，包括采集羊血样和羊奶样，提取核酸后进行 qPCR 检测。

下面来看看具体的研究结果：

• PCR 扩增和重组质粒制备结果：PCR 反应后，经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，产物成功回收并测序。构建的 pMD - S2 和 pMD - NS2 重组质粒，经菌液 PCR 鉴定和测序，证实重组成功，目标条带大小与预期相符，测序结果与原始基因序列同源性达 100%。
• 单 qPCR 优化结果：优化 qPCR 反应条件发现，S2 - HEX 和 NS2 - ROX 引物量为 0.8μL 时扩增曲线最佳；固定引物量为 0.8μL 后，S2 - HEX 探针量为 1.0μL、NS2 - ROX 探针量为 0.8μL 时扩增曲线最优。建立的标准曲线显示，S2 - HEX 和 NS2 - ROX 标准曲线的扩增效率分别为 103.1% 和 103.6%，R²均为 0.998，在有效范围内，可用于后续定量检测。特异性实验表明，该方法仅在布鲁氏菌 S2 疫苗株 DNA 作为模板时，S2 - HEX 组出现阳性扩增曲线；NS2 - ROX 组在布鲁氏菌 A19 疫苗株和布鲁氏菌 Rev.1 疫苗株作为模板时出现阳性扩增曲线，且与其他常见菌株无交叉反应。敏感性实验显示，qPCR 方法的最低检测限可达 1×10¹ copies/μL，比常规 PCR 敏感性高约 100 倍。重复性实验结果表明，两组单 qPCR 的组内变异系数约为 0.5%，组间变异系数小于 0.6% 。
• duplex qPCR 优化结果：采用棋盘法优化 duplex qPCR 反应体系，确定引物量为 0.8μL、S2 探针和 NS2 探针量为 0.8μL 时，S2 - HEX 和 NS2 - ROX 扩增曲线的 Ct 值最小。建立的 duplex qPCR 标准曲线，S2 - HEX 标准曲线扩增效率为 104.8%，R²为 0.999；NS2 - ROX 标准曲线扩增效率为 101.1%，R²为 0.996，重复性高，线性关系良好。特异性和鉴定效果实验表明，该方法能有效区分布鲁氏菌 S2 疫苗株与其他菌株，特异性良好。敏感性实验显示，duplex qPCR 的最低检测限可达 1×10¹ copies/μL，比常规 PCR 敏感性高约 100 倍。重复性实验中，组内 Ct 值变异系数小于 0.5%，组间变异系数小于 0.7%，重复性良好。
• duplex qPCR 方法的应用结果：对 30 只山羊进行实验，基于建立的 duplex qPCR 方法检测发现，推荐剂量组和双倍剂量组在免疫布鲁氏菌 S2 疫苗 3 天后均可检测到布鲁氏菌核酸，15 天时 Ct 值最低，表明细菌含量最高，之后逐渐下降，推荐剂量组 240 天、双倍剂量组 210 天和 240 天后核酸检测均为阴性。在羊奶检测中，10 份布鲁氏菌抗体阳性羊奶样本中有 5 份检测出布鲁氏菌 S2 疫苗株，2 份为布鲁氏菌 S2 疫苗株与野生株混合感染；10 份阴性羊奶样本中，2 份检测出布鲁氏菌 S2 疫苗株，1 份为混合感染。对 64 份羊血临床样本检测发现，共检测出 64 份布鲁氏菌阳性样本，其中 44 份为布鲁氏菌 S2 疫苗阳性，20 份为混合感染样本。

在研究结论和讨论部分，研究人员建立的 duplex qPCR 检测方法，相比血清学检测和常规 PCR 检测，具有 DNA 消耗少、敏感性高（比常规 PCR 高 100 倍）、检测时间短（约一个半小时）等优势，仅需一对引物和两个探针，最低检测限可达 10 copies/μL，能有效鉴别布鲁氏菌 S2 疫苗株和其他布鲁氏菌菌株。通过对奶山羊的免疫实验，明确了疫苗菌在体内的核酸检测时间和细菌含量变化规律，同时也证实该方法可检测羊奶和临床样本中的布鲁氏菌。这一研究成果为布鲁氏菌病的防控提供了新方法，有助于更好地开展疫病的检疫和净化工作，对保障畜牧业健康发展和公共卫生安全具有重要意义。