综述：细胞外囊泡的细胞外基质结合特性

《Cell Communication and Signaling》：ECM-binding properties of extracellular vesicles: advanced delivery strategies for therapeutic applications in bone and joint diseases

本文聚焦骨与关节疾病，综述了细胞外囊泡（EVs）表面生物分子与细胞外基质（ECM）成分的相互作用，探讨了基于 ECM 的生物材料作为 EVs 载体在骨与关节组织再生和免疫调节治疗中的作用，为骨与关节疾病治疗提供新思路。

　　

引言

骨骼和关节相互协作，共同守护着人体骨骼结构的完整性。然而，骨质疏松和关节炎等各类骨与关节疾病，给临床治疗带来了极大挑战。在全球范围内，50 岁以上人群中，骨质疏松分别影响着约 6.3% 的男性和 21.2% 的女性，这不仅增加了医疗费用，还因患者劳动能力下降而加重了社会经济负担。此外，骨质疏松患者骨折风险更高。骨关节炎（OA）则以慢性疼痛和活动受限为主要特征，是成年人中最为常见的关节炎类型。随着人口增长和老龄化加剧，OA 的发病率不断上升，且目前尚无有效的治愈方法。

破骨细胞、成骨细胞、软骨细胞、滑膜细胞以及免疫细胞，都是参与骨与关节内稳态调节的主要细胞类型。细胞外基质（ECM）作为骨骼和关节的重要无细胞成分，对细胞功能至关重要。骨 ECM 主要由 Ⅰ 型胶原蛋白和（碳酸化）羟基磷灰石构成，前者赋予骨骼拉伸强度，后者则提供抗压强度。此外，非胶原蛋白如骨钙素、骨桥蛋白和骨唾液蛋白等，在调节骨 ECM 重塑和细胞行为方面发挥着关键作用。软骨和滑膜组织中的 ECM，在微观层面影响细胞迁移，在宏观层面承担关节负重功能。与骨 ECM 不同，软骨 ECM 主要由 Ⅱ 型胶原蛋白和蛋白聚糖组成，蛋白聚糖凭借其带负电荷的特性，赋予软骨独特的抗压能力。滑膜包裹着关节腔，其衬里层的 ECM 由 Ⅲ 型胶原蛋白和层粘连蛋白构成，对关节润滑和营养物质交换起着重要作用。一旦组织特异性 ECM 的结构和组成出现异常变化，骨与关节的病理改变就会接踵而至。

近年来，细胞外囊泡（EVs）在骨与关节研究领域的诊断和治疗潜力逐渐受到关注。EVs 是一种脂质双分子层囊泡，直径范围在 30 - 2000nm 之间。根据大小，可分为（内体来源的）外泌体、源自质膜 / 细胞表面的微囊泡（30 - 1000nm）、较大的（>1000nm）凋亡小体以及大肿瘤小体。EVs 携带蛋白质、脂质、代谢物和核酸等多种货物，是细胞间通讯的重要媒介。例如，Wnt/β - catenin 和 NF - κB 信号通路参与了 EV 介导的骨代谢过程。EV 货物中的多种蛋白质，如转化生长因子 β（TGF - β）、骨保护素和表皮生长因子受体配体双调蛋白（AREG）等，都对 EVs 的生物学效应有所贡献。此外，浸润免疫细胞和滑膜成纤维样细胞（FLSs）来源的 EVs，在局部炎症期间介导关节的异常通讯。类风湿关节炎（RA）中 FLSs 来源的 TNF 阳性 EVs，已被证实可诱导 T 细胞产生抗凋亡作用；T 细胞来源的 EVs 则会促使 FLSs 增加基质金属蛋白酶（MMPs）和前列腺素 E₂（PGE₂）的合成，进而导致软骨 ECM 降解。研究还发现，携带 TGF - β 的牛乳 EVs，能够正向调节关节软骨细胞的稳态，保护软骨免受破坏。

EV 腔内加载

EVs 作为治疗性递送系统，可携带蛋白质、RNA 和小分子等货物。目前常用的加载方式有两种：被动加载，即货物自然融入 EVs；主动加载，则借助电穿孔等技术提高加载效率。比如，通过电穿孔将重组蛋白 Yap1 载入血小板来源的 EVs，可促进肌腱干细胞的年轻化，助力肌腱再生；将 CCL2 - siRNA 载入神经干细胞，有望用于治疗脊髓创伤性损伤，凸显了 EVs 在再生医学领域的巨大潜力。此外，基因工程细胞也可用于制备含有特定治疗性蛋白质或 RNA 的 EVs。例如，将长链非编码 RNA MEG3 用于骨肉瘤细胞的 EV 治疗，从转染 MEG3 的间充质干细胞（MSCs）中分离出的 EVs，能够有效抑制骨肉瘤细胞的生长。在这些应用中，EVs 就像坚固的运输舱，保护内部货物不被降解，并确保其精准送达目标组织。

EV 表面相互作用

大量表面生物分子锚定在 EV 表面，参与分子间相互作用，这一现象在生物医学各个领域都引发了广泛关注。以 HT1080 人纤维肉瘤细胞分泌的自分泌 EVs 为例，它们能够运输纤连蛋白，并与多种整合素连接形成新生黏附，从而促进亲代细胞高效且定向地运动。在自身免疫性疾病中，EVs 与自身抗体结合形成促炎免疫复合物，推动疾病的发展。特别值得一提的是，当 B 细胞来源的 EVs 携带功能性肽主要组织相容性复合体（MHC）时，抗原呈递效率会大幅提高。研究还发现，部分类风湿关节炎患者循环 EVs 上存在 IgM 类风湿因子，这一指标比 “游离” 的 IgM 类风湿因子更能快速反映前 B 细胞免疫变化和疾病活动度，且与更高的疾病活动度相关。

EV - ECM 相互作用

EV 表面分子与 ECM 成分的相互作用，对细胞活动和组织物理特性都有着重要的调节作用。细胞从 ECM 接收信号，进而影响 EVs 的形成。EVs 释放后，一系列生物分子和物理因素决定了它们是融入释放部位的 ECM 参与相关活动，还是被其他细胞摄取，亦或是分布到更远处的组织。有研究表明，EVs 一旦进入大分子 ECM 环境，就会被视为 ECM 的一个组成部分。一方面，EVs 可通过富含碱性氨基酸的肝素结合域，与纤连蛋白和胶原蛋白等 ECM 成分形成氢键。例如，骨组织细胞来源的 EVs 与胶原蛋白之间就存在这种氢键。另一方面，精氨酸（R）、甘氨酸（G）和天冬氨酸（D）（RGD）等结合域，或球状 N 端连接结构，是 EVs 膜上受体与 ECM 成分（如 α₄β₁整合素和 CD44）结合的关键因素。

鉴于 EVs 与 ECM 相互作用的重要性，本文着重回顾了有关 EV 表面生物分子的研究进展，旨在深入理解它们之间的相互作用机制。同时，通过分析动物实验数据，阐述了基于 ECM 的生物材料包裹 EVs 在骨与关节组织疾病的再生和免疫调节治疗中的高效递送作用。

表面生物分子引导 EVs 靶向骨代谢中的 ECM

整合素作为一种广为人知的黏附跨膜受体，表达于 EVs 表面，在 EVs 的选择性靶向过程中发挥着关键作用。整合素由 α（18 种）和 β（8 种）亚基组成，二者共同决定了整合素与特定配体结合的选择性。胶原蛋白和层粘连蛋白等 ECM 成分，含有能被特定整合素识别的基序。通常情况下，α₃β₁整合素参与与层粘连蛋白的结合，而 α₂β₁整合素则负责与胶原蛋白结合。例如，研究发现 MCF10 乳腺癌 EVs 在间质中运输时，含有 α₃β₁整合素的 EVs 能够与富含层粘连蛋白的 ECM 结合，这种相互作用会影响进入血液和淋巴毛细血管的 EVs 数量，进而决定 MCF10 EVs 在间质中的分布情况。此外，α₂β₁整合素介导的成肌纤维细胞来源的 EVs，能够优先与 Ⅰ 型胶原蛋白结合，促进胶原蛋白交联，调节成肌纤维细胞在伤口愈合过程中的活性。

在骨代谢过程中，还有其他整合素亚型发挥着作用。研究发现，在骨和牙齿吸收过程中，含有 α_Vβ₃整合素的破骨细胞 EVs 在骨组织中含量较高，因为它们对水解胶原蛋白具有亲和力；而含有 α₄β₁整合素的破骨细胞 EVs 在牙本质中更为常见。由此推测，整合素亚型能够引导 EVs 靶向特定的 ECM。此外，对 MSCs 来源的 EVs 进行蛋白质组学分析发现，这些 EVs 携带多种整合素和整合素配体，如胶原蛋白和层粘连蛋白家族分子，这表明 EVs 对组织中的相应 ECM 成分具有亲和力。

纤连蛋白 1（FN1）是一种糖蛋白，能够与胶原蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用。由 FN1 组装而成的粘弹性纤维，有助于 ECM 的成熟和组织特异性形成。在胚胎发育和伤口愈合过程中，FN1 的表达通常会上调。例如，伤口部位 FN1 基质的积累，有助于胶原蛋白的沉积，并在伤口收缩过程中发挥作用。细胞表面的 α₅β₁整合素作为结合 FN 基质的主要受体，通过 RGD 肽促进附近细胞的附着，增强 ECM 的稳定性。研究表明，在体外，成纤维细胞从伤口周围富含胶原蛋白的基质迁移到伤口床的过程依赖于 FN1。缺乏 FN1 时，成纤维细胞向纤维蛋白凝块的迁移会减少约 80%。在骨折修复过程中，FN1 在损伤后立即形成三维框架，为其他 ECM 成分的形成提供基础。在愈合的炎症阶段，中性粒细胞分泌细胞型 FN1 作为临时 ECM，吸引间充质干细胞（MSCs）、成纤维细胞和软骨 / 成骨祖细胞聚集到损伤部位。研究还发现，EVs 表面的 FN1 参与了骨缺损的愈合过程。给患有胫骨或颅骨缺损的大鼠静脉注射含有 FN1 的标记损伤神经元来源的 EVs 后，发现 EVs 能够进入循环系统并迁移到骨缺损组织中。用 FN1 抑制肽 GRGDNP 处理后，骨损伤组织中 EVs 的积累明显减少，这表明 FN1 能够引导 EVs 靶向骨组织。

表面生物分子引导 EVs 靶向关节疾病中的 ECM

CD44 属于归巢细胞黏附分子（HCAMs）家族，参与免疫细胞募集和肿瘤细胞转移过程，同时也是透明质酸（HA）的主要受体。在骨转移过程中，癌细胞表面的 HA 可能通过 CD44 介导得以保留。研究发现，CD44 基因敲低的细胞表面 HA 含量降低，而 CD44 过表达的细胞表面 HA 含量增加。免疫组化检查显示，HA 和 CD44 在某些癌细胞的骨转移灶中常常共定位，这表明 CD44 介导的捕获作用能够提高骨转移灶中 HA 的局部浓度。此外，滑膜腔中 HA 的沉积与 RA 密切相关。研究表明，RA 患者滑膜组织中 CD44 的表达量，相较于骨关节炎患者增加了 3.5 倍，相较于关节创伤但无慢性关节炎的患者增加了 10.7 倍，这表明 RA 患者滑膜细胞中 CD44 表达显著上调，且其表达水平与炎症强度相关。高分子量（HMW）的 HA 聚合物解聚形成的 HA 片段，可能通过与 CD44 结合激活炎症细胞，引发炎症反应。

近期研究发现，在人骨关节炎滑膜细胞模型中，脂肪干细胞（ADSCs）来源的 EVs 与 HA 基质之间存在直接结合。当 ADSCs 在 HA 包被的表面培养时，其分泌的 EVs 上 CD44 水平会升高，且这些 EVs 更容易被滑膜成纤维样细胞内化。这种相互作用被认为是干细胞 EVs 与 HA 联合关节内给药，相较于单独使用 HA 或 EVs，能够更有效地促进软骨再生的机制之一。然而，该研究中 EVs 上 CD44 水平的增加并不稳定。为了在 EVs 上稳定过表达 CD44，可以利用慢病毒转染或 Gateway 系统构建稳定表达 CD44v6（CD44 变异体 6）的细胞系，从而产生更多携带 CD44 的 EVs。

FN1 在 RA 滑膜成纤维细胞的发育过程中起着关键作用。这种 ECM 蛋白由滑膜成纤维细胞合成，参与关节中 Ⅲ 型胶原蛋白和层粘连蛋白的组成和结构形成，进而影响关节的结构完整性。在 RA 患者中，FN1 的过表达与滑膜增厚和血管翳形成密切相关，而血管翳形成是 RA 的一个重要特征，会导致免疫细胞浸润以及软骨和骨的降解。研究发现，RA 患者来源的 EVs 中能够显著检测到 FN1 的存在，而在反应性关节炎或骨关节炎患者来源的 EVs 中则不明显，这突出了 FN1 作为 RA 病理生理学标志物的特异性，尤其是在与 EVs 相关的方面。此外，在通过超速离心结合尺寸排阻色谱法分离和纯化的人滑膜液来源的 EVs（即所谓的 “致密” 或 “冠” EVs）中，也能够检测到 FN1 的存在。考虑到 EV - 纤连蛋白复合物具有促炎特性，之前的实验结果可能受到 FN1 与 EVs 共分离假象的影响。而且，蛋白质冠会干扰 EVs 的生物活性和治疗作用，FN1 与白蛋白和凝血酶原共同作用，会影响 EVs 在生物流体中的分布能力和靶向递送效果。通过蛋白酶 K 和胰蛋白酶等酶处理，可以水解 EVs 表面冠蛋白中的特定蛋白质，从而影响冠蛋白和 EVs 的结构与功能。因此，在 EVs 给药时，利用这些酶对 EVs 表面进行功能化修饰具有重要意义。

EV 表面在骨与关节 ECM 重塑中的作用

ECM 降解在骨组织中的作用

基质金属蛋白酶（MMPs）属于 metzincin 超家族，是一类广为人知的蛋白酶。它们能够作用于胆固醇、细胞膜表面受体以及几乎所有类型的 ECM 蛋白质。破骨细胞激活的 MMPs 和组织蛋白酶 K，主要参与骨中三螺旋 Ⅰ 型胶原蛋白的分解过程。研究发现，Mmp9 基因双敲除 / 条件性 Mmp14 基因敲除的小鼠，骨稳态转换减少，能够有效抵御病理性骨丢失。此外，含有 MMP - 13 的基质小泡（MVs）可以暴露并激活潜伏的转化生长因子 β2（TGFβ - 2），进而促使前成骨细胞侵入软骨并分化为成骨细胞，加速 OA 的进展。敲低成熟成骨细胞来源的 EVs 中 MMP2 的表达后，发现其在促进内皮细胞迁移、增殖和管腔形成方面起着关键作用。有趣的是，人尿源干细胞（USCs）来源的 EVs 中含有金属蛋白酶组织抑制剂 1（TIMP1），静脉注射这种 EVs 能够显著改善小鼠模型的骨质量，这主要是通过将 TIMP1 直接递送至衰老组织，抑制与衰老过程相关的基质 MMPs 实现的。

ECM 降解在关节组织中的作用

MMPs 家族中的 MMP - 1、MMP - 2 和 MMP - 13 等成员，普遍存在于 OA 和 RA 患者的滑膜细胞、破骨细胞和成纤维细胞等多种细胞来源的 EVs 中。这些酶参与了 ECM 成分（如胶原蛋白和蛋白聚糖）的分解过程，而胶原蛋白和蛋白聚糖对于维持软骨的完整性至关重要。EVs 表面的 MMPs 能够通过切割结构蛋白，积极参与 ECM 的更新，导致关节组织的降解。表达 MMPs 的 EVs 有助于调节炎症反应和细胞侵袭，这两个过程在关节疾病的 ECM 重塑中都起着关键作用。例如，RA 患者滑膜成纤维样细胞（FLSs）来源的 EVs，能够上调软骨细胞中 MMP - 13 和 ADAMTS - 5 的表达，进一步加剧软骨降解，促进关节 ECM 的病理性重塑。这些相互作用会促进组织侵袭和炎症反应，加速 RA 等疾病中关节的破坏。此外，滑膜组织中的炎症环境会驱动新血管的形成。随着 EVs 表面的 MMPs 降解胶原蛋白和蛋白聚糖，ECM 的分解会释放出血管内皮生长因子（VEGF）等促血管生成因子和其他细胞因子。这些因子会刺激内皮细胞增殖并形成新血管，导致炎症细胞、营养物质和免疫介质向关节的输送增加，加剧炎症循环，进一步促进 ECM 的降解。具体而言，携带 MMP - 2、MMP - 9 和 MMP - 13 等 MMPs 的 EVs，能够进一步增强 ECM 成分的降解并促进血管生成，形成关节炎症和组织破坏的恶性循环。MMP9 和 MMP8 在活性氧的影响下协同激活 MMP2，共同促进软骨胶原蛋白的分解和血管生成。

ECM 矿化在骨组织中的作用

骨中的 Ⅰ 型胶原蛋白或关节软骨内软骨骨化过程中的 Ⅹ 型胶原蛋白，会由于大量沉积的羟基磷灰石晶体交织在胶原蛋白三螺旋结构中而发生钙化。成骨细胞、肥大软骨细胞或巨噬细胞分泌的基质小泡（MVs）被认为是 ECM 矿化的起始位点。膜联蛋白钙通道蛋白将 MVs 锚定在胶原纤维上，随后促进钙离子的流入。钙离子与 MVs 内膜上的磷脂（主要是磷脂酰丝氨酸）相互作用，形成预磷灰石矿物相。特别值得一提的是，膜联蛋白（如膜联蛋白 Ⅱ、Ⅳ 和 Ⅴ）、磷脂酰丝氨酸和组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）在 MVs 表面富集，有助于螯合形成羟基磷灰石晶体所需的钙离子，推动骨和软骨内矿化过程中 ECM 从主要的有机结构转变为有机和无机材料的复合物。此外，转化生长因子 β 受体 Ⅱ 相互作用蛋白 1（TRIP - 1）位于内质网中，与其他起始成分共同控制蛋白质的合成。有研究报道，TRIP - 1 在细胞外具有调节基质矿化的作用。近期研究发现，MC3T3 - E1 细胞来源的 EVs 参与了 TRIP - 1 向 ECM 的运输<