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为解决多药耐药结核病（MDR-TB）诊断难题，研究人员开展基于 CRISPR-Cas14a 技术检测结核分枝杆菌（MTBC）耐利福平（RIF）和异烟肼（INH）突变的研究。结果显示该平台敏感性和特异性高，能快速检测，对结核病诊断和防控意义重大。
结核病，这一古老却依旧猖獗的传染病，至今仍严重威胁着全球公共健康。据估算，2023 年约有 40 万新增患者被诊断为耐利福平结核病（RR-TB）或多药耐药结核病（MDR-TB） ，然而当年全球 MDR/RR-TB 的治疗覆盖率仅为 44%，治疗成功率也相对较低，仅 68%。传统的表型药敏试验（pDST）虽为金标准，但耗时长达三个月之久，严重延误治疗时机。分子检测技术虽崭露头角，但现有方法在检测耐药突变时存在局限性，如部分技术检测位点有限，有的成本高昂、检测时间长。因此，开发一种快速、准确且高效的检测耐利福平（RIF）和异烟肼（INH）突变的方法迫在眉睫。
在此背景下，深圳第三人民医院（国家传染病临床研究中心、广东省结核病临床研究中心，同时也是南方科技大学附属医院）的研究人员积极开展研究。他们成功开发了 CRISPR-Cas14a MTB RIF/INH 平台，致力于解决耐药结核病诊断难题。相关研究成果发表于《BMC Microbiology》。
研究人员在开展研究时，运用了多种关键技术方法。首先是样本采集，临床分离株来自广东省结核病控制中心，痰样本则取自深圳第三人民医院的疑似结核病患者。接着，利用 PCR 测序确定基因突变，通过合成和纯化 Cas14a1 蛋白、设计并制备 gRNA，进行多重 PCR 扩增，最后开展 CRISPR-Cas14a 反式切割试验。此外，还对检测限（LOD）和特异性进行测定，并运用统计分析评估数据。
研究结果如下：
- 平台检测原理：该平台通过多重 PCR 扩增临床样本，产物加入含有 Cas14a、特定 gRNA、T7 核酸外切酶（T7E）和 FQ 报告基因的反应腔，根据荧光信号判断是否存在突变。设计了 gRNA-WT 和 gRNA-M 分别匹配野生型和突变位点，不同的荧光信号组合代表不同的基因型。
- 多重 PCR 扩增效果：采用多重 PCR 策略，成功在同一反应中同时扩增 rpoB、katG 和 inhA 基因，产物条带清晰，大小符合预期，且无非特异性扩增，经 Sanger 测序验证，为后续实验奠定基础。
- gRNA 设计及效果评估：针对 RIF 和 INH 耐药相关的常见突变位点设计 gRNA，利用合成的单链 DNA（ssDNA）底物进行 CRISPR 切割试验。结果表明，设计的 gRNA-WT 和 gRNA-M 能准确区分野生型和突变位点，为平台检测耐药突变提供了有效工具。
- 平台敏感性和特异性评估：对 H37Rv 菌株 DNA 进行系列稀释确定 LOD，部分 gRNA 的 LOD 低至 5 - 20 拷贝 / 反应。利用多种分枝杆菌和大肠杆菌的基因组 DNA 评估特异性，部分 gRNA 对结核分枝杆菌 H37Rv 特异性强，证明该平台具有高敏感性和特异性，可用于结核分枝杆菌的检测。
- 平台在临床分离株中的应用：以 60 株临床分离株为研究对象，对比 pDST 和 Sanger 测序，平台检测 RIF 耐药的敏感性为 93.3%，特异性为 100%；检测 INH 耐药的敏感性为 97.5%，特异性为 100%。虽存在个别误判，但整体表现良好。
- 平台在痰样本中的应用：对 55 份痰样本进行检测，与 pDST 相比，平台检测 RIF 耐药的敏感性为 85.7%，特异性为 100%；检测 INH 耐药时与 pDST 结果一致，显示出平台可直接检测痰样本中的耐药突变，缩短诊断时间。
研究结论和讨论部分指出，该平台优势显著。它能在 2.5 小时内完成检测（包括核酸提取），相比世界卫生组织（WHO）推荐的大多数分子快速诊断测试（mWRD），检测时间大幅缩短。且成本低，无需昂贵设备，有利于大规模推广，尤其适用于贫困地区。然而，平台也存在局限性，如 gRNA 覆盖范围局限于热点区域，可能漏检突变；检测通量较低；实验操作在开放环境进行，有气溶胶污染风险。未来研究将探索整合微流控技术，优化升级平台，同时收集更多临床样本进行多中心联合测试，进一步验证其有效性。
总的来说，这项研究开发的 CRISPR-Cas14a 平台为耐药结核病的快速诊断带来了新希望，在结核病防控领域具有重要的潜在应用价值，有望推动结核病诊断技术的发展，改善患者的治疗现状。
