基于人源 m6Am 甲基转移酶 PCIF1 的酵母萜类化合物高效合成策略

《Microbial Cell Factories》：Introduction of human m6Am methyltransferase PCIF1 facilitates the biosynthesis of terpenoids in Saccharomyces cerevisiae

为解决微生物细胞工厂生产潜力有待提升的问题，研究人员开展了引入人源 N6,2’-O - 二甲基腺苷（m6Am）甲基转移酶 PCIF1 对酿酒酵母萜类生物合成影响的研究。结果显示 PCIF1 可促进萜类合成，该研究为优化酵母萜类生物合成提供新策略。

　　在生命科学的微观世界里，微生物细胞工厂正逐渐成为生产高价值天然产物的 “得力助手”。像青蒿素、紫杉醇等药物，檀香醇、长叶烯等化妆品原料，以及除虫菊酯、印楝素等农业化学品，都能借助微生物细胞工厂来合成。然而，目前的代谢工程策略虽多，但仍难以满足工业生产的需求，就像给微生物细胞工厂打造的 “工具箱” 还不够完善，需要寻找更高效的代谢途径优化策略，这便是此次研究开展的重要原因。

滨州医学院的研究人员踏上了探索之旅，他们聚焦于引入人源 N⁶,2’-O - 二甲基腺苷（m⁶Am）甲基转移酶 PCIF1 对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）萜类生物合成的影响。最终他们发现，PCIF1 的引入显著促进了萜类化合物的合成，这一成果发表在《Microbial Cell Factories》上，为微生物细胞工厂的优化提供了新的方向。

研究人员开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。首先是基因工程技术，构建质粒和菌株，将 PCIF1 等基因导入酿酒酵母中；其次利用转录组测序技术，分析基因表达变化；还通过气相色谱 - 质谱联用（GC-MS）技术，检测目标化合物的含量 ，从多方面对实验进行检测与分析。

下面来看看具体的研究结果：

• PCIF1 促进酿酒酵母中角鲨烯的生物合成：研究人员把 PCIF1 基因表达模块整合到酿酒酵母 CEN.PK2-1 C 菌株基因组中，得到 TP01 菌株。半定量 RT-PCR 证实 PCIF1 在酵母细胞中高表达，且 TP01 菌株比野生型（WT）菌株生长更具优势。GC-MS 分析发现，TP01 菌株角鲨烯生物合成显著增强，产量比 WT 菌株增加 2.3 倍，这表明 PCIF1 能促进酵母中三萜化合物的生物合成。
• PCIF1 显著影响酵母代谢和应激反应相关基因的表达：对 TP01 和 WT 菌株进行转录组测序分析，发现 1821 个差异表达基因（DEGs）。GO 和 KEGG 富集分析表明，这些差异基因主要参与氧化还原过程、碳水化合物代谢、磷代谢过程、转移酶活性、氧化还原酶活性等，PCIF1 在调节酵母的氧化还原过程、碳代谢、次级代谢和氨基酸合成中起关键作用。同时，PCIF1 过表达使细胞氧化还原过程相关功能基因富集，还上调了细胞壁完整性（CWI）丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路中信号分子编码基因的表达，这意味着 PCIF1 可能通过影响应激反应相关基因来提高酵母细胞的应激耐受性。
• PCIF1 通过增加乙酰辅酶 A 的生物合成促进角鲨烯的产生：研究人员对比 TP01 和 WT 菌株的三萜生物合成途径和上游甲羟戊酸（MVA）途径，发现转录组数据未显示这两条途径中基因表达水平显著增加，部分酶表达下调。由于乙酰辅酶 A 是 MVA 的前体，研究人员转向乙酰辅酶 A 合成途径。转录组测序显示，TP01 菌株中糖酵解途径的大多数基因表达上调，丙酮酸转化为乙酰辅酶 A 的两条途径中相关基因也上调，负责将线粒体中乙酰辅酶 A 以柠檬酸形式转运到细胞质的 CTP1 基因同样上调，说明 PCIF1 通过上调糖酵解和乙酰辅酶 A 合成途径来促进三萜化合物的生物合成。
• PCIF1 增加工程酵母中角鲨烯的产量：为评估 PCIF1 在工程菌株中提升三萜产量的能力，研究人员构建了增强三萜输出的工程菌株。优化 MVA 途径得到 TP04 菌株，进一步优化三萜生物合成途径得到 TP05 菌株，其角鲨烯产量为 120.59±5.24mg/L。将 PCIF1 表达模块插入 TP05 菌株基因组得到 TP06 菌株，其角鲨烯产量达 274.10±12.92mg/L，相比 TP05 菌株增加 2.3 倍，表明 PCIF1 能显著提高工程酵母中角鲨烯的产量。
• PCIF1 增强工程酵母中倍半萜的生物合成：以长叶烯为代表评估 PCIF1 对倍半萜生物合成的影响。在优化 MVA 途径的 TP04 菌株基础上，替换 ERG9 基因启动子，转入长叶烯合酶基因 PsLS 得到 TP08 菌株，其长叶烯产量为 2.35±0.39mg/L。构建融合蛋白并转入 TP07 菌株得到 TP09 菌株，长叶烯产量达 11.46±1.01mg/L。将 PCIF1 表达盒插入 TP09 菌株基因组得到 TP10 菌株，长叶烯产量为 16.23±0.30mg/L，相比 TP09 菌株增加 1.4 倍，说明基于 PCIF1 的代谢工程方法可增强工程酵母菌株中倍半萜的产量。

研究结论与讨论部分意义重大。研究首次揭示 PCIF1 参与调节糖酵解和乙酰辅酶 A 合成途径，使这些途径中的关键酶上调，乙酰辅酶 A 池富集，进而刺激萜类生物合成，在工程酵母菌株中，角鲨烯和长叶烯产量分别提高 2.3 倍和 1.4 倍 。这为乙酰辅酶 A 衍生化合物，尤其是萜类化合物的代谢工程策略提供了新方向。未来研究可进一步探究 PCIF1 在促进其他乙酰辅酶 A 衍生化合物生产中的作用，拓展其在天然产物生物合成中的应用。同时，研究还发现 PCIF1 影响酵母细胞的氧化还原过程、激活 MAPK 通路，增强细胞壁完整性，提高酵母发酵过程中的抗性，为深入理解微生物细胞代谢调控机制提供了新视角。此次研究成果为微生物细胞工厂的优化和天然产物的高效合成带来了新的希望，推动了生命科学和健康医学领域的发展。