《Molecular Cancer》综述：癌症中由小开放阅读框编码的微蛋白：鉴定、生物学功能及临床意义

这篇综述聚焦癌症中由小开放阅读框（sORF）编码的微蛋白。详细阐述了微蛋白的翻译机制、鉴定方法，其在癌症中的表达失调情况，以及调控基因表达等生物学功能。还探讨了微蛋白作为诊断、预后标志物及治疗靶点的临床意义，为癌症研究提供新视角。

　　

癌症中微蛋白的研究进展

在生命科学的广袤领域中，人类基因组一直是研究的核心对象。过去，人们普遍认为人类基因组中仅有约 3% 的序列能够编码蛋白质，其余大部分被视为非编码 RNA（ncRNAs）。然而，随着研究的不断深入，一个全新的领域逐渐浮现 —— 小开放阅读框（sORF）编码的微蛋白。这些微蛋白虽然长度通常少于 100 个氨基酸，却在各种生物过程中发挥着至关重要的作用，尤其是在癌症领域，正逐渐成为研究的热点。

微蛋白的翻译机制

微蛋白的翻译机制多样且复杂。真核生物的 mRNA 一般具有 7 - 甲基鸟苷（m⁷G）帽和多聚腺苷酸（poly (A)）尾结构，多数 mRNA 以此为基础，通过帽依赖的方式进行翻译。在这个过程中，小核糖体亚基（40 S）首先与 eIF4F 复合物结合，识别 mRNA 的 5′帽结构，然后沿着 mRNA 扫描，找到起始密码子 AUG，之后招募大核糖体亚基（60 S），形成 80 S 翻译核糖体，启动多肽合成。许多具有 “mRNA - 样” 结构的 lncRNA，也采用这种帽依赖的方式翻译出微蛋白。

除了经典的帽依赖翻译，还有一些特殊的翻译方式。例如，漏扫描机制类似于帽依赖翻译，但核糖体亚基在扫描过程中可能会识别上游开放阅读框（uORF）的起始密码子，从而翻译出微蛋白。有时候，核糖体亚基也会跳过上游的起始密码子，继续扫描下游，直至找到主要开放阅读框（mORF）并启动翻译。像 SLC35A4 mRNA，其 mORF 编码的蛋白质定位于高尔基体，而 uORF 翻译出的微蛋白 SLC35A4 - MP 则定位于线粒体内膜。

对于缺乏 5′帽结构和 3′ poly (A) 尾的 circRNAs 和某些 lncRNAs，它们通过内部核糖体进入位点（IRESs）依赖的翻译方式进行翻译。IRESs 是位于 ORF 上游的高度结构化的顺式作用 RNA 元件，能够招募核糖体至起始密码子附近，促进翻译过程。如 circPDHK1，其含有 IRES 序列，编码的 PDHK1 - 241aa 肽在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中发挥着促进肿瘤生长和转移的作用。

N⁶ - 甲基腺苷（m⁶A）修饰也在微蛋白的翻译中扮演重要角色。m⁶A 修饰由甲基转移酶和去甲基酶动态调控，一些 RNA 结合蛋白（如 IGF2BP1 和 YTHDF1/2/3）可以识别 m⁶A 修饰位点，招募翻译机器，促进 sORF 的翻译。例如，circMIB2 在甲基转移酶 METTL14 和 METTL16 的作用下，m⁶A 水平升高，其编码的微蛋白 MIB2 - 134aa 表达也随之增加。

微蛋白的鉴定方法

由于微蛋白的特殊性，其鉴定面临诸多挑战，目前主要通过多种方法相结合来实现。

生物信息学工具在微蛋白预测中发挥着重要作用。这些工具通过分析基因组或转录组数据来预测微蛋白，有的基于 ORF 分析，有的则结合 m⁶A 修饰或 IRES 元件与 ORF 的存在情况进行综合分析。例如，ORF - FINDER 是最早开发的通过序列比对在 cDNA 中搜索 ORF 的工具，而 CPAT 则利用基于四个序列特征的逻辑回归模型，能够更准确地从候选转录本中识别编码和非编码转录本。此外，还有专门用于预测 sORF 的工具，如 sORF Finder 和 MiPepid，它们在评估 sORF 编码潜力方面各有优势。

核糖体图谱测序（Ribo - Seq）是研究细胞内全局翻译活动的高通量测序技术。实验过程包括细胞裂解释放核糖体及其结合的 mRNA，消化未被核糖体保护的 mRNA，分离核糖体保护的 mRNA 片段并构建 cDNA 测序文库进行高通量测序。后续通过数据分析，可以识别翻译起始和终止位点、翻译效率及潜在编码区域，广泛应用于探索 sORF 的翻译潜力。为了更有效地分析 Ribo - Seq 数据，开发了多种软件工具，如 RiboTaper、RibORF 和 RiboCode 等，它们利用核糖体保护片段的三联体周期性来检测活跃翻译区域，但这些方法可能会受到数据质量和覆盖度的影响。

质谱（MS） - 基于的蛋白质组学方法能够直接检测微蛋白的特定肽段，为微蛋白的鉴定提供了有力证据。在鉴定过程中，首先需要对微蛋白进行富集，由于微蛋白丰度较低，常采用凝胶分离、分子截留过滤、有机溶剂沉淀等多种方法。之后进行 MS 样品制备、数据采集和原始数据分析。数据采集模式包括数据依赖采集（DDA）和数据独立采集（DIA），DIA 能够捕获低丰度和高丰度分子，更适合微蛋白检测。目前，已经有一些公开数据库（如 SmProt、sORFs.org和 OpenProt）用于 MS 原始数据分析，结合多种数据库可以提高微蛋白鉴定的准确性。

在预测或检测到微蛋白后，还需要进行实验验证。常用的方法包括外源性表达和内源性检测。外源性表达是将 sORF 与荧光蛋白或表位标签融合构建表达质粒，导入细胞后通过免疫印迹和免疫荧光检测微蛋白的表达。内源性检测则是利用针对微蛋白开发的特异性抗体进行检测，但由于部分微蛋白分子量小、抗原性低，开发有效抗体存在困难，此时可以借助 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术，插入荧光或表位标签，便于检测微蛋白的表达和定位。

微蛋白在癌症中的表达失调

越来越多的证据表明，sORF 编码的微蛋白在多种恶性肿瘤中存在广泛的表达失调，这与癌症的发生发展密切相关。

转录因子的失调会影响微蛋白编码转录本的表达。例如，转录因子 GATA3 在 ccRCC 中表达降低，导致其对 LINC00887 转录的抑制作用减弱，进而使 LINC00887 及其编码的微蛋白 ACLY - BP 上调。相反，在肝细胞癌（HCC）中，TGF - β 激活的转录因子 SMAD3 促进了 LINC02551 的转录，使其编码的微蛋白 JunBP 显著上调。

circRNAs 的生成受到多种因素的调控，其异常生成会导致编码微蛋白的表达失调。如在肝内胆管癌（ICC）中，DExH - box 解旋酶 9（DHX9）表达降低，解除了对 circRNA cGGNBP2 形成的抑制，使得 cGGNBP2 及其编码的微蛋白 cGGNBP2 - 184aa 水平升高。此外，剪接因子也在 circRNA 生物发生中发挥重要作用，在三阴性乳腺癌（TNBC）中，剪接因子 SLU7 表达下调，导致 circCAPG 的环化受到抑制，其编码的微蛋白 CAPG - 171aa 表达减少。

RNA 修饰的异常同样会影响微蛋白编码转录本的表达。以 m⁶A 修饰为例，在 HCC 中，METTL14 介导的 circSTX6 的 m⁶A 修饰抑制了 circSTX6 的表达，进而使 circSTX6 - 144aa 微蛋白下调；而在乳腺癌（BC）中，METTL14 却通过依赖 IGF2BP1 的方式上调 lncRNA LY6E - DT 及其编码的微蛋白 MRP 的表达，这显示出 METTL14 在不同癌症中的复杂调控作用。

翻译起始因子的变化也会影响微蛋白的翻译效率。在 HER2 阳性的 BC 中，NRF2 对 eIF3J 的转录抑制，使得 eIF3J 对 circ - βTrCP 肽翻译的抑制作用减弱，导致 circ - βTrCP 肽表达增加，进而赋予肿瘤细胞对曲妥珠单抗的耐药性。

此外，E3 泛素连接酶可以促进微蛋白的降解，影响其丰度。例如，在 HCC 中，circMAP3K4 编码的微蛋白 circMAP3K4 - 455aa 受到 E3 泛素连接酶 MIB1 的调控，MIB1 通过泛素化作用缩短其半衰期。

微蛋白在癌症中的生物学功能

微蛋白在癌症中参与多种生物学过程，对基因表达的调控贯穿转录、剪接、mRNA 稳定性、蛋白质翻译及翻译后修饰等多个层面。

在基因转录调控方面，一些微蛋白可以直接与转录因子或其相关结合伙伴相互作用。比如，LINC - PINT 编码的微蛋白 PINT87aa 能够与转录因子 FOXM1 的 DNA 结合域结合，抑制其转录活性，进而影响 HCC 细胞的生长。hsa_circ_0000437 编码的微蛋白 CORO1C - 47aa 则与 ARNT 的 PAS - B 域相互作用，阻止 ARNT 与转录因子 TACC3 结合，抑制 VEGF 的转录，影响子宫内膜肿瘤的血管生成。

在 RNA 剪接调控中，微蛋白与关键剪接因子相互作用，精确调节可变剪接。LINC00982 编码的微蛋白 PRDM16 - DT 通过与 hnRNP A2B1 竞争性结合，影响 CHEK2 转录本的剪接，促进长异构体 L - CHEK2 的形成，同时抑制短异构体的产生。LOC90024 编码的微蛋白 SRSP 则增强 SRSF3 与 Sp4 转录本外显子 3 的结合，促进致癌长异构体 L - Sp4 蛋白的产生，抑制非致癌短异构体 S - Sp4 的表达。

微蛋白还可以通过与 RNA 结合蛋白（RBPs）相互作用，影响靶 mRNA 的稳定性。LINC00266 - 1 编码的微蛋白 RBRP 与 IGF2BP1 结合，增强其对 c - Myc mRNA 上 m⁶A 修饰的识别能力，提高 c - Myc mRNA 的稳定性和翻译效率，促进肿瘤发生。lncRNA LY6E - DT 编码的微蛋白 MRP 与 HNRNPC 相互作用，增强 HNRNPC 与表皮生长因子受体（EGFR）mRNA 的结合，稳定 EGFR mRNA，促进 EGFR 蛋白的表达，在 BC 中发挥促癌作用。

在蛋白质翻译调控方面，微蛋白可以作为支架调节翻译相关复合物的组装和功能。lncRNA ASH1L - AS1 编码的微蛋白 APPLE 促进 PABPC1 与 eIF4G 的相互作用，推动 mRNA 环化和 eIF4F 起始复合物的组装，支持肿瘤相关的翻译程序。

在翻译后修饰调控中，微蛋白与相关酶相互作用，影响蛋白质的泛素化和磷酸化等修饰。circZKSCAN1 编码的微蛋白 circZKSaa 与 E3 泛素连接酶 FBXW7 相互作用，促进 mTOR 的泛素化和降解，抑制 mTOR 信号通路。LINC00261 编码的微蛋白 N1DARP 干扰 Notch1 细胞内结构域（N1ICD）与泛素特异性肽酶 10（USP10）的相互作用，导致 N1ICD 的多泛素化，抑制 Notch1 信号通路。此外，circHEATR5B 编码的微蛋白 HEATR5B - 881aa 通过促进 Jumonji C 结构域蛋白（JMJD5）的磷酸化，降低其稳定性，但具体分子机制仍有待进一步阐明。

微蛋白在癌症中的作用

微蛋白在癌症的发生发展过程中扮演着至关重要的角色，通过多种机制影响肿瘤的增殖、凋亡、血管生成、转移和代谢重编程等关键过程。

在调节增殖信号方面，c - Myc 作为重要的致癌转录因子，其表达水平与肿瘤生长密切相关。LINC00266 - 1 编码的肿瘤相关肽 RBRP 通过增强 IGFBP1 与 c - Myc mRNA 的相互作用，提高 mRNA 稳定性，促进结直肠癌（CRC）的进展。而 FBXW7a 转录本的环状异构体编码的微蛋白 FBXW7 - 185aa 则加速 c - Myc 蛋白的降解，抑制肿瘤生长。此外，MYC mRNA 的 5′ - UTR 编码的分泌性微蛋白 MPEP，作为 TRKB 受体酪氨酸激酶的激动性配体，能够促进胶质母细胞瘤干细胞的生长，且不依赖于 MYC 蛋白的功能。

MAPK/ERK 信号通路在肿瘤增殖中也起着关键作用，多个微蛋白参与其调控。在食管鳞状细胞癌（ESCC）中，circUBE4B - 173aa 与 MAPK1 直接相互作用，增强其磷酸化，促进 MAPK/ERK 介导的细胞增殖。而在胃癌（GC）中，MAPK1 的环状转录本编码的微蛋白 MAPK1 - 109aa 通过竞争性结合 MEK1，抑制 MAPK1 的激活及其下游促增殖信号，发挥抑癌作用。

在抵抗细胞死亡方面，微蛋白参与调节细胞凋亡和铁死亡等过程。在凋亡调节中，lncRNA LINC00278 编码的微蛋白 YY1BM 在 ESCC 细胞中通过抑制 caspase - 3 的表达来抑制细胞凋亡。其机制是 YY1BM 阻碍转录因子 Yin Yang 1（YY1）与雄激素受体（AR）的相互作用，抑制真核延伸因子 2 激酶（eEF2K）的转录，进而解除 eEF2K 对真核延伸因子 2（eEF2）的抑制性磷酸化，促进 caspase - 3 的翻译和表达。在 caspase 非依赖性凋亡中，circMAP3K4 编码的微蛋白 circMAP3K4 - 455aa 在 HCC 中通过与凋亡诱导因子（AIF）直接相互作用，阻止其 N 端切割和核转位，使肿瘤细胞对顺铂诱导的凋亡产生抗性。

在铁死亡调节方面，circFOXP1 编码的微蛋白 circFOXP1 - 231aa 在 ICC 细胞中通过与去泛素化蛋白酶 OTUD4 相互作用，增强核受体共激活因子 4（NCOA4）的稳定性和表达，促进铁死亡。而 LINC02381 编码的微蛋白则通过调节 NRF2 信号通路，影响胶质母细胞瘤中的铁死亡过程，但具体机制尚待进一步研究。此外，微蛋白在坏死和焦亡等其他形式的细胞死亡中的作用仍有待探索。

在调节血管生成方面，肿瘤的快速生长依赖于新生血管的形成，微蛋白在其中发挥着重要的调节作用。lncRNA MLLT4 - AS1 编码的微蛋白 XBP1SBM 通过增强转录因子 XBP1s 的核定位，促进 VEGF 的转录，从而驱动 TNBC 中的血管生成。相反，LINC00908 编码的 ASRPS 肽和 hsa_circ_0000437 编码的 CORO1C - 47aa 则作为 VEGF 转录的负调节因子，分别通过与 STAT3 和 ARNT 相互作用，抑制 VEGF 的转录，表明微蛋白在肿瘤血管生成中的作用具有多样性和情境依赖性。

在调节肿瘤转移方面，微蛋白参与多条关键信号通路的调控。TGF - β/Smad 信号通路在肿瘤转移中起着重要作用，在 GC 中，该通路的激活上调 circ - E - Cad 及其编码的微蛋白 C - E - Cad 的表达，C - E - Cad 通过增强 Snail 和 Slug 等转录因子的表达，促进上皮 - 间质转化（EMT），推动肿瘤转移。而在 TNBC 中，TGF - β/SMAD 信号通路下调 LINC00665 编码的微蛋白 CIP2A - BP 的表达，CIP2A - BP 通过抑制 PI3K/AKT/NFκB 通路，减少 MMP - 2、MMP - 9 和 Snail 的表达，阻碍 EMT 过程，抑制肿瘤转移。

Wnt/β - catenin 信号通路也是肿瘤转移的关键调控通路。在 GC 中，AXIN1 的环状转录本编码的微蛋白 AXIN1 - 295aa 通过竞争性结合 APC，抑制 GSK3β 介导的 β - catenin 降解，使细胞质中的 β - catenin 积累并转位到细胞核，驱动与 GC 转移相关基因的转录激活。circβ - catenin 编码的微蛋白 circβ - catenin - 370aa 则通过竞争性结合 GSK3β，保护 β - catenin 不被降解，促进 Wnt/β - catenin 信号通路的激活和肿瘤转移。在 TNBC 中，微蛋白 EIF6 - 224aa 通过稳定 MYH9，增强 MYH9 介导的 GSK3β 降解，放大 β - catenin 信号，促进 TNBC 转移。

此外，在 ICC 中，IL - 6 通过上调 circRNA GGNBP2 及其编码的微蛋白 cGGNBP2 - 184aa 的表达，cGGNBP2 - 184aa 与 STAT3 直接相互作用，促进 STAT3^Tyr705的磷酸化，形成 IL - 6/cGGNBP2 - 184aa/STAT3 正反馈回路，维持 IL - 6/STAT3 信号通路的持续激活，促进 ICC 转移，凸显了癌症转移网络的复杂性。

在重编程细胞代谢方面，肿瘤细胞的代谢重编程是其重要特征之一，微蛋白在其中发挥着不可或缺的调节作用。在葡萄糖代谢中，“Warburg 效应” 是肿瘤细胞<