综述：法医 FFPE 分子分析中是否充分考虑了预分析因素？系统综述揭示标准化程序的必要性

《International Journal of Legal Medicine》：Are pre-analytical factors fully considered in forensic FFPE molecular analyses? A systematic review reveals the need for standardised procedures

这篇综述聚焦法医 FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织样本的分子分析。研究发现多数相关文献未充分报告预分析因素（如濒死时间、死后间隔时间（PMI）等），影响结果可靠性。作者提出使用标准化表格记录相关信息，以提升法医分子结果的可信度，值得关注。

　　

引言

在诊断病理学中，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织是重要基础，尤其用于活体患者活检。在此领域，严格的操作流程是确保样本完整性和诊断准确性的关键，涵盖样本处理、固定、包埋和切片等多个环节，还需遵循特定的核酸提取指南。

FFPE 组织在法医病理学中也应用广泛，常通过 “分子尸检” 技术，将传统尸检结果与分子数据相结合，以深入探究死亡原因。比如在不明原因的猝死（SUD），特别是心脏性猝死（SCD）案例中，分子尸检可识别与心律失常相关的基因突变，辅助确定死因。在药代遗传学研究中，分析特定基因能了解个体对药物的代谢差异，判断药物与死亡的关联，并为家属医疗提供参考。此外，分子分析在溺水、缢死与死后悬吊鉴别、死后间隔时间（PMI）估计、个体识别等方面都发挥着重要作用。

然而，FFPE 样本的固定和包埋过程会损害核酸，而且在这之前的多个预分析因素（如濒死时间、PMI、固定时间和 FFPE 储存条件等）也会影响分子检测结果，原因在于核酸会发生酶促和自发降解，非编码 RNA 的表达水平也会改变。因此，本研究旨在系统回顾相关科研文献，评估这些预分析因素是否得到充分报告和考虑，并制定标准化协议。

材料和方法

研究按照 PRISMA 2020 标准，使用 PubMed 和 Scopus 搜索引擎进行系统文献回顾。检索 2000 年 1 月 1 日至 2023 年 12 月 31 日期间发表的研究，关键词涵盖 DNA、RNA、FFPE、尸检、法医等领域。初步筛选出 376 篇论文，经去除重复记录、非英文或综述 / 社论类文章，以及不符合研究范围（如动物研究、非人类遗传物质研究、人类肿瘤研究、活检组织研究）的文章后，最终纳入 50 篇文章进行分析。

结果与讨论

50 篇文章中，27 篇聚焦 DNA 研究（26 篇针对基因组 DNA，1 篇针对线粒体 DNA），20 篇聚焦 RNA 研究，3 篇同时考虑了 DNA 和 RNA。研究分析了核酸提取前的预分析阶段因素，主要包括濒死时间、死亡至组织固定时间（TSD-TF）、固定过程、包埋等。

1. 濒死时间：在 50 项关于 DNA 和 / 或 RNA 的研究中，仅有 15 项（30.0%）报告了濒死时间（LA） 。这些研究主要涉及突然不明原因死亡（SUD）或心脏性猝死（SCD）案例，濒死时间差异较大，从极短的暴力死亡（<10 分钟）到长达 16 天的多器官衰竭案例。虽然 LA 对 DNA 结构影响较小，但会改变基因表达水平，因此准确记录 LA 对 RNA 研究尤为重要。研究还推荐使用 4 点 Hardy Scale 对 LA 进行分类，并建议在无法准确确定时使用 “00” 表示，同时记录濒死期的医疗治疗和临床状况123。
2. 死亡至组织固定时间（TSD-TF）：TSD-TF 在法医分子研究中至关重要，它与传统意义的 PMI 有所不同。在本研究中，50 篇论文里仅有 18 篇（36.0%）报告了死亡至尸检取器官的时间（即 “预采样” 时间），其中 RNA 研究的比例为 23.3%（7/30），DNA 研究为 60.8%（14/23） 。这段时间在 DNA 研究中为 6 小时至超 14 天，RNA 研究中为 1 小时至 21 天。此外，仅有 7 篇（14.0%）明确表明组织在尸检后 “立即” 固定，多数研究缺少 “采样后” 阶段的数据。TSD-TF 应细分为 “预采样”（包括从死亡到送 morgue 的 pre-S1 阶段和在 morgue 到器官移除的 pre-S2 阶段）和 “采样后” 阶段，各阶段的时间和温度等信息都应详细记录456。
3. 固定过程：50 篇研究中，26 篇（52.0%）报告了福尔马林浓度和 / 或固定时间，固定液浓度多为 4 - 20%，多数使用 10% 缓冲福尔马林，固定时间在 DNA 研究中从 6 小时到 31 年不等，RNA 研究中从 24 小时到 37 个月不等 。多数研究使用的固定时间远超推荐标准（24 - 48 小时或 ISO 推荐的 12 - 24 小时），过长的固定时间会增加核酸降解和修饰，影响分子分析结果，特别是基因表达水平的评估。因此，应详细报告固定处理的时长、温度，以及整个器官固定时的特殊处理和固定液更换情况789。
4. 包埋：50 篇研究中，27 篇（54.0%）报告了 FFPE 样本的老化情况，老化时间在 DNA 研究中为 30 天至 40 年，RNA 研究中为 7 天至 17 年 。仅有 16.0% 的研究报告了环境储存条件，多数样本在 “室温避光” 条件下储存。FFPE 样本的老化和储存条件会影响分子结果，因此这些细节需要被仔细评估和记录。
5. 组织样本：除 1 篇 DNA 研究外，所有 RNA 和 DNA 研究都报告了用于分子分析的组织样本。心脏肌肉是最常被研究的组织，其次是大脑和肝脏。由于不同组织在死后自溶过程中对 RNA 的降解程度不同，明确组织样本类型对评估分子分析结果很重要10。
6. 预分析因素对 FFPE 样本分子分析的影响：随着分子技术在法医调查中的重要性日益增加，详细记录预分析条件变得至关重要，因为这些条件会影响组织样本质量，进而影响 “组学” 分析的准确性和可靠性 。DNA 和 RNA 在死后都会发生降解，其降解程度受死亡原因、死后时间和环境条件等因素影响。mRNA 的表达模式会因濒死因素和死后时间发生变化，miRNA 虽相对稳定，但也会受多种预分析因素影响。此外，长时间不恰当的固定和 FFPE 样本储存会导致核酸化学损伤，所以组织固定和 FFPE 储存步骤对评估分子数据至关重要111213。

结论

本研究回顾了 50 篇涉及法医尸检 FFPE 样本 DNA 和 / 或 RNA 检测的论文，发现多数文献缺乏预分析参数的关键数据，这可能影响分子分析结果的准确性和解释 。为解决这一问题，作者设计了一份标准化表格，法医病理学家需详细填写预分析过程中的关键步骤，包括组织类型、濒死因素时间表、样本收集和处理、储存时间和条件、组织固定方法等。通过标准化预分析步骤，法医界可更好地比较和评估不同分子检测结果，提高法医研究的可重复性和分子数据在法律背景下的可靠性。