新型内体逃逸增强化合物的设计与筛选：提升寡核苷酸体外功能递送效率

本文报道了新一代内体逃逸增强剂（EEEs）的开发，通过质子海绵效应促进剪接转换寡核苷酸（SSOs）、缺口寡核苷酸（gapmers）及小干扰RNA（siRNAs）的胞质释放。研究发现，EEEs通过上调囊泡组织相关基因表达，显著提升GalNAc-siRNA的活性，为多模态寡核苷酸疗法提供了高效递送策略。

　　内体逃逸增强化合物的突破性设计
研究团队通过结构活性关系（SAR）分析，优化了32种内体逃逸增强剂（EEEs），其中EEE4和EEE32表现突出。这些化合物通过质子海绵机制破坏内体膜，促进寡核苷酸逃逸。GAL9招募实验证实，EEE4在1.25 μM浓度即可诱导内体破裂，且细胞毒性显著低于前代化合物。

作用机制与功能验证
基因本体（GO）分析显示，EEE4处理上调了囊泡运输和线粒体自噬相关基因。通过HeLa_Luc705报告系统，EEE4使剪接转换效率提升400倍，且与内体酸化抑制剂巴弗洛霉素A1联用后活性降低，证实其依赖pH梯度。值得注意的是，24小时预孵育SSO后添加EEE4的效果优于共处理，暗示EEE4可穿透已内化的内体。

多模态寡核苷酸治疗的应用拓展
在神经母细胞瘤（N2a）细胞中，EEE4将MALAT1缺口寡核苷酸的IC₅₀降至7.3 nM。原代人肝细胞实验中，非偶联siPPIB+EEE32的活性（IC₅₀ 10 nM）媲美GalNAc-siPPIB（9 nM），而两者联用更使基因沉默效果提升10倍。SOD1 siRNA实验进一步验证了EEEs的广谱增强能力。

毒性优化与临床潜力
引入哌啶环的gem-二甲基修饰（EEE32）降低了细胞毒性，同时保留活性。RNA测序显示，5 μM EEE4触发线粒体应激通路，但治疗浓度（2-2.5 μM）未引发显著毒性。该研究为克服寡核苷酸内体滞留难题提供了化学优化范例，其与GalNAc的协同效应尤具转化价值。