病毒介导增强传出抑制减轻野生型小鼠耳蜗声损伤：基因疗法新希望

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：Virally mediated enhancement of efferent inhibition reduces acoustic trauma in wild-type murine cochleas

为解决噪声性听力损失（NIHL）缺乏有效治疗手段的问题，约翰霍普金斯大学医学院研究人员开展了通过内耳基因疗法增强耳蜗传出抑制以减轻 NIHL 的研究。结果显示，病毒表达的 α9L9′T可减轻听力损失，为 NIHL 治疗提供了新策略。

　　在当今社会，随着个性化音响设备的广泛使用以及城市环境中高分贝噪音的充斥，噪声性听力损失（Noise-induced hearing loss，NIHL）正逐渐成为一个全球性的重大健康难题。据世界卫生大会预测，到 2050 年，全球将近 25 亿人会受到听力损失的困扰。2019 年，已有 15.7 亿人不同程度地遭受听力损失，这使其成为全球疾病负担的第三大诱因，经济成本高达 9810 亿美元以上，且主要影响低收入群体和老年人。目前，除了佩戴防护设备和远离高分贝环境外，尚无美国食品药品监督管理局批准的预防 NIHL 的疗法。在此背景下，研究如何通过基因疗法来预防或减轻 NIHL 显得尤为重要。
约翰霍普金斯大学医学院的研究人员开展了一项旨在探索内耳基因疗法能否增强耳蜗的天然反射，进而减轻体内 NIHL 的研究。他们将目光聚焦于内侧橄榄耳蜗（medial olivocochlear，MOC）反射系统，该系统从脑干的上内侧橄榄复合体向耳蜗的感觉上皮（柯蒂氏器）提供传出神经支配。MOC 反射通过释放乙酰胆碱（acetylcholine，ACh），作用于外毛细胞（outer hair cells，OHCs）上的（α9）₂（α10）₃烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic ACh receptor，nAChR），引发一系列离子通道变化，使 OHCs 超极化并分流其电运动，从而防止噪音引起的过度激活，对耳蜗起到保护作用。研究人员发现，将苏氨酸替换为 α9 亚基第二个跨膜结构域 9′位置的亮氨酸（L9′T），可产生对 ACh 敏感性增加、通道平均开放时间延长的 α9^L9′T异构体，能增强 MOC 效应。此前研究表明，α9^L9′T转基因敲入小鼠比野生型小鼠更能抵御噪音引起的阈值变化，而 α9 基因敲除小鼠则对噪音更敏感。基于此，本次研究团队尝试在野生型小鼠中表达带有 HA 标签的 α9^L9′T异构体，以减轻 NIHL，相关成果发表在《Molecular Therapy Methods 》上。
为开展此项研究，研究人员采用了多种关键技术方法。在动物实验方面，选用 C57Bl/J6 野生型小鼠，在其出生后 1 - 5 天，通过左耳后半圆管注射携带 α9^L9′T-HA 序列的腺相关病毒 2.7m8（AAV2.7m8），部分小鼠作为未注射对照组，还有部分注射 AAV2.7m8-CAG-eGFP 作为手术和病毒对照。实验过程中，利用听觉脑干反应（Auditory brainstem response，ABR）评估小鼠听力，在噪音暴露前后不同时间点进行 ABR 测量。实验结束后，通过免疫组织化学方法对耳蜗组织进行染色，观察相关蛋白表达及突触情况。
研究结果如下：

1. α9^L9′T-HA 的表达定位：免疫荧光标记显示，α9^L9′T-HA 在 OHCs 的突触后膜广泛表达，且从耳蜗顶部到基部呈递减梯度。在注射侧的 IHCs 中，也有大量弥漫性细胞质 HA 免疫标记，同样从顶部到基部减少。在对侧耳蜗，HA 标记主要局限于基部区域。这表明病毒成功转导，且 α9^L9′T-HA 定位符合预期。
2. 基线 ABR 阈值和波 1 振幅：与未注射对照组相比，注射 α9^L9′T-HA 的小鼠在 8 - 16kHz 频率范围内基线 ABR 阈值略有升高，波 1 振幅在部分频率也有差异，但在最高测试频率处，两组差异不显著。这说明 α9^L9′T-HA 的表达对听觉功能有一定影响，但在高频率段影响较小。
3. 噪音暴露后的 ABR 变化：所有小鼠在 5 周龄时暴露于 8 - 16kHz、100dB 的噪音 1 小时后，注射 α9^L9′T-HA 的小鼠在 1、7、14 天的 ABR 绝对阈值和阈值变化均显著低于对照组。该组小鼠在 14 天时，部分频率的绝对阈值已恢复至接近噪音暴露前的水平，而对照组则存在明显的永久性阈值偏移。这表明 α9^L9′T-HA 能有效减轻噪音暴露后的听力损失，且促进听力恢复。
4. 噪音暴露后的波 1 振幅变化：噪音暴露 1 天后，所有组的 80dB SPL 点击波 1 振幅均减半。之后，对照组点击振幅几乎无恢复，而 α9^L9′T-HA 组在 14 天时显著大于对照组，接近噪音暴露前水平。纯音 80dB 波 1 振幅分析也显示，α9^L9′T-HA 组在 7 天和 14 天的振幅显著大于未注射组，尤其在 16 - 32kHz 频率范围内。这说明 α9^L9′T-HA 能保护 IHC 到传入神经的传输，减少永久性损伤。
5. IHC 突触计数：噪音暴露 15 - 17 天后，对 IHC 传入突触进行计数，结果显示注射 α9^L9′T-HA 的耳蜗与对照组相比，突触数量无显著差异。这可能意味着噪音暴露引起的波 1 振幅减小并非由突触数量变化导致，而是与突触功能变化有关。
   研究结论表明，病毒表达的 α9^L9′T能与天然的 α9 和 α10 亚基有效结合，形成功能性的 nAChRs，增强 MOC 反馈，从而减轻野生型小鼠耳蜗的 NIHL。该研究为 NIHL 的治疗提供了新的策略和方向，有望发展成为 “传出基因疗法”。不过，未来还需进一步评估其对全身的不良影响，探索对其他疾病如疼痛性听觉过敏（noxacusis）的治疗潜力，以及优化基因治疗方案，如使用 OHC 特异性启动子，以减少对其他细胞类型的转导和脱靶效应。