基于纳米抗体的肉毒神经毒素A/B快速检测方法的理性设计与应用研究

《Analytica Chimica Acta》：Rational design and pairing of single-domain antibodies for developing rapid detection methods for botulinum neurotoxins A and B

本研究针对肉毒神经毒素(BoNT)检测方法灵敏度不足、耗时长等问题，通过理性设计六种纳米抗体(VHH)，开发了两种ELISA方法和时间分辨荧光免疫层析法(TRFICA)。研究发现TRFICA检测限低至0.05 ng/mL，15分钟即可完成检测，临床样本检测灵敏度达98%。该研究为生物反恐、食品安全和临床诊断提供了高效检测方案。

　　肉毒神经毒素(BoNT)作为自然界中毒性最强的生物毒素之一，其检测一直是公共卫生安全领域的重大挑战。由肉毒梭菌产生的这种毒素，仅需极微量就能导致肌肉麻痹甚至死亡，更因其可能被用作生物武器而备受关注。然而，传统检测方法如小鼠生物测定耗时长达4天，现有免疫检测技术又面临抗体制备复杂、检测灵敏度不足等瓶颈。针对这一难题，军事医学科学院等机构的研究团队在《Analytica Chimica Acta》发表创新成果，通过纳米抗体技术开辟了快速检测新途径。

研究采用生物层干涉仪(BLI)分析、重组蛋白表达纯化、双抗体夹心ELISA和时间分辨荧光免疫层析等关键技术，对49例临床样本和30例对照样本进行系统验证。从表达纯化BoNT/A/B抗原入手，基于已报道的VHH结合表位，筛选出ciAC2、ciAH7等6种纳米抗体，通过(G₄S)₃连接子构建双价捕获抗体，并融合HRP或V5标签制备检测抗体。

研究结果部分显示：在"BoNT和纳米抗体的表达纯化"中，SDS-PAGE证实成功获得纯度＞90%的150 kDa BoNT和6种纳米抗体（41-63.1 kDa），每500 mL菌液可制备9-89 mg不等的抗体。"亲和力测定"数据显示所有VHH对BoNT的亲和力(KD)达47.1-658 pM，其中A-capture抗体亲和力最高（47.1 pM）。"ELISA方法的建立"部分显示，优化后的ELISA 1在牛奶中的检测限为0.17 ng/mL（BoNT/A），显著优于ELISA 2的4.5 ng/mL。"TRFICA方法的建立"证实该技术检测限低至0.05 ng/mL（沙土样本），且15分钟即可完成检测。"临床样本验证"表明TRFICA对49例疑似病例的检测灵敏度达98%，特异性为96.7%。

讨论部分强调，该研究创新性地将VHH理性设计与快速检测技术结合：1）通过表位分析指导抗体串联，使A-capture抗体亲和力提升近10倍；2）首次实现HRP-VHH融合蛋白直接用于ELISA，将检测时间从100分钟缩短至70分钟；3）建立的TRFICA方法灵敏度媲美"金标准"小鼠实验，且更适合现场检测。尽管血清基质可能干扰检测，但该研究为生物防御和临床诊断提供了可量产的低成本解决方案，其技术路线对其它毒素检测也具有重要借鉴意义。