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本文揭示玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）效应子 EtEC81 可调节玉米前体 mRNA 可变剪接（AS）并负调控病菌致病性。EtEC81 与 ZmEIP1 互作，协同调控 AS 并激活免疫。研究为解析玉米 - 大斑病菌互作机制及防控大斑病（NLB）提供新视角。
### 研究背景
在植物与病原菌的相互作用中，前体 mRNA（pre-mRNA）的可变剪接（AS）发挥着重要作用。AS 是真核生物中普遍存在的转录后调控方式，能产生多种 mRNA 异构体，增加转录组和蛋白质组的多样性 。植物通过模式识别受体（PRRs）识别病原菌相关分子模式（PAMPs）引发 PAMP 触发的免疫（PTI），或通过抗性（R）蛋白识别病原菌分泌的效应子激活效应子触发的免疫。而病原菌则会分泌效应子干扰植物免疫，部分效应子可通过重编程宿主植物的 mRNA 剪接来抑制植物免疫。
玉米是重要的粮食和饲料作物，大斑病（NLB）由大斑病菌（Exserohilum turcicum）引起，严重影响玉米产量和质量。目前对大斑病菌效应子的了解有限，其干扰宿主植物 pre-mRNA 剪接以调节植物免疫的分子机制尚未见报道。
研究目的
本研究旨在鉴定大斑病菌中参与调节植物 AS 的效应子，解析其作用机制以及在玉米与大斑病菌互作中的功能，为防控大斑病提供理论依据和潜在靶点。
研究方法
- 筛选候选效应子：重新分析已发表的玉米接种大斑病菌后的 RNA 测序（RNA-seq）数据，挑选出 126 个候选效应子基因，利用基于荧光素酶的剪接报告系统筛选能够调节 AS 的效应子。
- 基因编辑与功能验证：通过同源重组敲除大斑病菌中的EtEC81基因，构建突变体菌株；利用病毒诱导的基因过表达（VOX）系统在玉米中瞬时过表达EtEC81，分析其对玉米免疫反应的影响。同时，使用 CRISPR/Cas9 技术敲除玉米中的ZmEIP1基因，构建过表达株系，研究其在植物免疫中的作用。
- 蛋白质互作分析：运用酵母双杂交（Y2H）技术筛选与 EtEC81 互作的蛋白，通过 GST pull-down、split luciferase complementation 和双分子荧光互补（BiFC）等实验验证蛋白间的相互作用。
- 转录组分析：对过表达EtEC81、ZmEIP1的玉米植株及对照植株进行 RNA-seq 分析，鉴定差异表达基因（DEGs）和差异 AS 事件；通过 RNA 免疫沉淀测序（RIP-seq）探究 EtEC81 与 RNA 的结合情况。
研究结果
- EtEC81 调节植物中的 AS：从 126 个候选效应子中筛选出 EtEC81，其能显著降低荧光素酶（LUC）活性，影响RLPK基因的 AS。亚细胞定位显示 EtEC81 定位于细胞核，且其调节 AS 的功能依赖于核定位信号（NLS）。
- EtEC81 负调控大斑病菌的致病性：EtEC81基因敲除突变体的致病性增强，表明 EtEC81 在大斑病菌致病过程中起负调控作用。
- EtEC81 触发玉米的免疫反应：在玉米中瞬时过表达EtEC81引发坏死病变和超敏反应，增强了对几丁质诱导的活性氧（ROS）爆发和防御相关基因的表达，说明 EtEC81 可触发植物免疫反应，限制病原菌感染。
- EtEC81 与 ZmEIP1 相互作用：Y2H 筛选得到与 EtEC81 互作的蛋白 ZmEIP1，多种实验证实二者在体外和体内均能相互作用，且互作发生在细胞核中。
- ZmEIP1 正调控植物免疫：ZmEIP1基因敲除突变体对大斑病菌更敏感，而过表达株系抗性增强，表明 ZmEIP1 正调控植物对大斑病菌的免疫反应。
- ZmEIP1 参与 AS 调节：ZmEIP1 可改变RLPK基因的 AS，且与多个剪接体成分相互作用，KEGG 分析显示这些成分参与 RNA 加工过程。EtEC81 和 ZmEIP1 共同作用对 AS 的调节效果更强。
- RNA-seq 分析：RNA-seq 鉴定出在过表达EtEC81或ZmEIP1的玉米植株中，有 1629 个共同的 DEGs，KEGG 分析表明这些基因富集在植物免疫相关途径。同时，发现 119 个共同的差异 AS 事件，主要为内含子保留类型。对部分 AS 基因的验证和功能分析显示，一些基因在调节植物对大斑病菌的免疫反应中起重要作用。
- EtEC81 与 RNA 的结合：RIP-seq 结果表明 EtEC81 具有 RNA 结合活性，能结合多个基因的 mRNA，但与内含子保留 mRNA 的重叠基因较少，说明其可能通过间接方式调节下游基因的 AS。
研究结论
本研究发现大斑病菌效应子 EtEC81 通过靶向玉米中的 ZmEIP1 重编程 pre-mRNA 剪接，激活植物免疫反应，负调控大斑病菌的致病性。这一发现揭示了玉米与大斑病菌互作的新机制，为深入理解植物 - 病原菌相互作用以及开发大斑病防控新策略提供了重要的理论基础。同时，研究也存在局限性，如 EtEC81 激活植物免疫的具体机制以及其在不同宿主和病原菌背景下的功能仍有待进一步研究。
