通过一步法构建人骨髓间充质干细胞 - 胶原定向排列体系实现自发性骨再生：开拓骨修复新路径

《Acta Biomaterialia》：Spontaneous bone regeneration achieved through one-step alignment of human mesenchymal stem cell-embedded collagen

在骨组织工程中，优化细胞 - 基质相互作用以实现有效骨再生是一大难题。研究人员开展了关于开发人骨髓间充质干细胞（hMSCs）嵌入的 3D 定向胶原促进骨再生的研究。结果表明，该方法可使 hMSCs 自发分化为成骨细胞，有效促进新骨形成，为骨修复提供了新平台。

　　在人类历史长河中，骨折一直是困扰医学界的重大难题。如今，交通事故、体育活动以及老年人的骨质疏松等问题，使得骨折的发生率居高不下。对于严重的骨损伤或大的骨缺损，传统的生物惰性金属材料制成的植入式骨固定装置已无法满足治疗需求，此时就需要生物活性材料或先进的组织工程技术来助力骨骼愈合。在众多研究方向中，利用干细胞疗法，将人骨髓间充质干细胞（hMSCs）嵌入 3D 水凝胶用于骨再生成为了热门研究领域。然而，目前对于如何优化水凝胶的化学组成和物理性质，以更好地促进 hMSCs 的存活和分化，仍有待进一步探索。同时，天然骨组织中胶原纤维的定向排列对细胞 - 细胞外基质（ECM）相互作用以及 hMSCs 成骨分化的影响机制，也尚未完全明确。在此背景下，韩国大学医学中心等研究机构的研究人员开展了一项极具意义的研究，该研究成果发表在《Acta Biomaterialia》上。

研究人员为了深入探究如何促进骨再生，采用了一系列关键技术方法。在细胞培养方面，使用特定的培养基培养 hMSCs；通过制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具，并对其进行处理，为后续构建定向胶原提供基础；运用扫描电子显微镜（SEM）和能量色散 X 射线光谱（EDX）等技术，对细胞和胶原的结构、成分进行分析；借助免疫荧光成像、逆转录聚合酶链反应（RT - PCR）等方法，检测细胞的分化和相关基因的表达；在动物实验中，建立大鼠颅骨缺损模型，利用微计算机断层扫描（micro - CT）对新骨形成进行动态观察，并通过组织学分析评估新骨的生物学特性 。

下面来详细介绍研究结果：

1. 制备定向 3D 胶原：研究人员通过对 PDMS 模具进行预拉伸，将胶原溶液加载到模具上，在特定时间内释放应变，成功制备出了定向的 3D 胶原。通过计算定向指数（OI），发现施加应变后，胶原纤维能够良好地沿 x 轴方向排列，OI 值从无应变时的 - 0.09 提升到 0.56。
2. 定向 3D 胶原作为 hMSCs 的培养平台：实验表明，hMSCs 在定向 3D 胶原中具有较高的存活率，尽管随着培养时间增加，其存活率略有下降，但在 14 天时仍保持在 90% 以上。同时，hMSCs 在定向 3D 胶原中的增殖能力虽略低于在 2D 培养条件下，但依然维持着较强的增殖活性。随着培养时间的延长，hMSCs 的形态逐渐发生变化，细胞变得更加细长，细胞核呈椭圆形且与定向胶原纤维的方向一致，其肌动蛋白丝也与 3D 胶原的取向相关，这表明胶原的定向排列能够引导细胞的取向和伸长。
3. hMSCs 在定向 3D 胶原中的自发成骨分化：通过茜素红染色和 EDX 分析发现，hMSCs 在定向 3D 胶原中，即使在没有添加成骨诱导培养基（OS）的情况下，7 天就出现了明显的钙沉积，且持续增加至 14 天，而在 2D 培养且添加 OS 的条件下，hMSCs 的钙沉积在 7 - 14 天才逐渐增加，在非定向 3D 胶原中，hMSCs 的钙沉积程度则较弱。RT - PCR 分析显示，在定向 3D 胶原中，hMSCs 的成骨相关基因如 Runx2 和碱性磷酸酶（ALP）的表达水平显著上调，与在 2D 培养且添加 OS 条件下的表达水平相当。进一步研究发现，BMP2 - Smad1/5 信号通路被激活，同时整合素 α2（ITGA2）与胶原的相互作用增强，激活了丝裂原活化蛋白激酶 / 细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）通路，共同促进了 hMSCs 的成骨分化。
4. ITGA2 介导的 FAs 在定向 3D 胶原中的特征：免疫荧光分析表明，在定向 3D 胶原中，ITGA2 介导的 FAs 与胶原纤维的共定位程度增加，其形状随着培养时间的延长而变得更加细长，面积也有所增大。对 ITGA2 的各项参数进行量化分析发现，其纵横比（AR）显著增加，与胶原共定位的 ITGA2 的 AR 和面积也明显增加，且 ITGA2 FAs 的取向受定向 3D 胶原几何线索的影响，在定向胶原中呈现出与胶原纤维方向一致的单峰分布。通过小干扰 RNA（siRNA）敲低 ITGA2 后，hMSCs 的成骨相关基因表达降低，细胞形态变圆，FA 无法形成，这进一步证实了 ITGA2 在 hMSCs 成骨分化中的关键作用。
5. 体内骨再生：将负载 hMSCs 的定向 3D 胶原应用于大鼠颅骨缺损模型中，通过 micro - CT 成像观察发现，该组在术后早期（4 - 6 周）的骨愈合速度最快，且新骨从缺损内部开始形成，而非从现有正常骨的边缘生长。在术后 8 周，该组的骨体积百分比（13.3%）显著高于随机定向 hMSCs 组（1.3%），新形成骨的厚度（0.760mm）约为随机定向组（0.298mm）的 2.5 倍，新骨覆盖面积也明显增加。组织学分析显示，新形成的骨组织中有活跃的骨重塑现象，存在大量的成骨细胞、骨样沉积以及血管和破骨细胞。对新形成骨的微观结构进行量化分析发现，该组的骨小梁厚度、数量、表面密度均最高，骨小梁模式因子最低，表明其骨再生效果最佳，骨组织的强度和稳定性更好。

综上所述，研究结论和讨论部分指出，通过对 hMSCs 和胶原水凝胶混合物在完全凝胶化前施加应变，成功将细胞嵌入胶原基质，创建了一个有利于成骨分化的定向微环境。定向 3D 胶原能够模拟天然骨环境，促进 hMSCs 的增殖和自发成骨分化，即使在没有 OS 的情况下也能有效促进骨生成。该研究揭示了整合素 - ECM 相互作用在 3D 物理环境中对 hMSCs 分化的重要性，强调了 3D ECM 环境在决定干细胞命运中的关键作用。同时，研究人员也指出，虽然该研究为骨再生提供了一种有前景的细胞治疗平台，但在对 hMSCs 嵌入的胶原凝胶施加机械应变方面，还需要进一步改进处理方法，以提高实验的可重复性和实现大规模生产。这一研究成果为骨组织工程和再生医学领域带来了新的思路和方法，有望推动相关领域的进一步发展，为解决骨缺损等临床问题提供更有效的方案。