钙依赖激活核糖核酸酶 EndoU 的分子机制：解锁真核生物 RNA 调控新密码

为探究真核生物中 EndoU 依赖钙离子激活的机制，研究人员通过生物物理、计算技术及体外实验展开研究。结果发现钙离子结合引发分子内信号传导和结构变化激活 EndoU，该机制可能在真核生物中保守，为研究真核 EndoU 提供重要依据。

　　在微观的细胞世界里，核糖核酸酶（RNases）如同勤劳的 “分子工匠”，默默地参与着 RNA 的加工和降解工作，对细胞功能和免疫反应起着至关重要的作用。其中，EndoU - 样超家族的核糖核酸内切酶广泛存在于细菌、真核生物和某些病毒中，它们与核糖核酸酶 A - 样超家族有着古老的进化联系。然而，不同生物中的 EndoU 激活方式差异很大。细菌中的 EndoU 和动物的 RNase A 无需辅助因子就能发挥作用，而真核生物的 EndoU 催化域却依赖二价金属离子，尤其是钙离子。这一现象引发了科学家们的浓厚兴趣：真核生物中 EndoU 依赖钙离子激活的背后，究竟隐藏着怎样的分子机制呢？为了解开这个谜团，来自法国波尔多大学（Univ. Bordeaux）、美国加利福尼亚大学河滨分校等研究机构的研究人员展开了深入研究。最终，他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们揭示了这一过程的神秘面纱。
研究人员采用了多种技术方法来开展此项研究。结构研究方面，运用 X 射线晶体学解析了钙结合状态下 hEndoU 的晶体结构，同时利用 NMR 光谱技术研究蛋白结构与动力学变化；功能验证上，通过定点突变构建多种 hEndoU 突变体，结合 RNA 降解实验和电泳迁移率变动分析（EMSA）检测酶活性与 RNA 结合能力；此外，还借助分子动力学（MD）模拟从原子层面探究钙结合及蛋白 - RNA 相互作用机制。
在研究结果部分：

• 钙依赖的 RNase 活性：研究人员通过对小鼠胸腺细胞的研究发现，mEndoU 在胸腺细胞发育过程中表达，且其核糖核酸酶活性具有强烈的钙依赖性。利用小鼠胸腺淋巴瘤细胞系 VL3 - 3M2 进行实验，在野生型（WT）细胞提取物中加入钙离子后，RNA 出现明显降解，而在 mEndoU 基因敲除（KO）的细胞提取物中则没有这种现象，补充 WT 或 HA 标记的 mEndoU 后又能恢复 RNA 降解，这表明 VL3 - 3M2 提取物的钙依赖核糖核酸酶活性源于 mEndoU。进一步实验发现，mEndoU 能切割多种 RNA 序列，且仅钙离子能刺激其切割活性，在 1 - 2 mM 钙离子浓度下活性最佳 。
• hEndoU 激活的结构基础：研究人员先构建了无钙 hEndoU（apo - hEndoU）的同源模型，随后利用 NMR 光谱技术研究二价金属离子对 hEndoU 结构和动力学的影响。结果发现，镁、镍、锶等金属离子会导致 NMR 信号丢失，而钙离子能恢复分散的峰。通过解析钙激活 hEndoU 的晶体结构，发现 5 个钙离子，其中 4 个可能激活蛋白。钙结合引发了分子内信号传导，使催化三联体附近的蛋白环发生构象变化，关键残基 E290 在其中起到重要的介导作用 。
• hEndoU 激活模型的实验验证：研究人员设计了一系列 hEndoU 突变体进行 RNA 降解实验，结果表明破坏与催化核心和 N 端延伸相关的钙结合位点（1）或（3）会使酶活性丧失，而破坏其他钙结合位点则影响较小。MD 实验显示，钙结合位点（1）和（3）之间存在相互作用，可能共同促进 hEndoU 的激活。此外，突变关键残基 E290 会影响酶活性，带负电荷的 E290 侧链对 hEndoU 的变构激活最为有利 。
• 钙激活的 hEndoU 与 RNA 的复合物：研究发现，钙离子能促进 hEndoU 与 RNA 的结合，形成尿苷酸特异性复合物和高阶复合物。通过 NMR 实验确定了 RNA 结合表面位于蛋白的 C 端催化核心区域，该区域富含 β - 折叠，表面呈碱性，适合 RNA 结合。利用 AlphaFold 和 MD 模拟构建了钙激活 hEndoU 与 RNA 的复合物模型，通过对模型中与 RNA 结合关键残基的突变研究，进一步验证了模型的准确性 。
  在研究结论与讨论部分，研究人员成功揭示了 hEndoU 依赖钙激活的分子机制。钙离子通过变构作用激活 hEndoU，而非直接参与催化，这一机制可能在所有真核生物的 EndoU 中保守。钙结合位点（1）和（3）对 hEndoU 激活至关重要，相关残基来自催化核心和真核生物特有的 N 端延伸，N 端延伸起到了钙传感器的作用。此外，研究还发现钙离子促进 hEndoU 与 RNA 的结合独立于酶的激活。不过，目前对于 hEndoU 激活对钙离子特异性的分子基础尚未明确，不同物种中 EndoU 的定位和 RNA 靶点存在差异，未来还需进一步研究其在不同生理环境中的作用。这项研究为深入理解真核生物中 EndoU 的功能和调控机制提供了重要基础，有助于探索其在 RNA 代谢相关疾病中的潜在作用，也为开发针对相关疾病的治疗策略提供了新的思路。