Endosomal chloride/proton exchangers 的关键调控机制：TMEM9 β -subunits 的重要作用

《Nature Communications》：Endosomal chloride/proton exchangers need inhibitory TMEM9 β-subunits for regulation and prevention of disease-causing overactivity

在细胞内膜泡离子稳态研究中，为探究内体 Cl-/H+交换的调控机制，研究人员开展了关于内体 ClC-3、ClC-4 和 ClC-5 与 TMEM9 及 TMEM9B 关系的研究。结果发现 TMEM9 和 TMEM9B 是内体 CLC 的必需 β - 亚基，可调节其功能。该研究揭示了内体离子运输的调控机制，具有重要意义。

　　在细胞的微观世界里，内体（endosome）和溶酶体的正常运作对细胞功能至关重要，而这一切都离不开跨膜离子运输。以往的研究大多聚焦于内体的 pH 值调节，然而，像氯离子（Cl^-）这样的其他离子同样起着关键作用。CLC 氯离子 / 质子交换器（CLC chloride/proton exchangers）作为内体 Cl^-运输的主要参与者，其功能异常会引发多种严重疾病。但目前对于内体 CLC 的调控机制，尤其是是否存在相关辅助亚基等问题，仍存在诸多未知。为了深入探究这些问题，来自德国莱布尼茨分子药理学研究所（Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie，FMP）等机构的研究人员开展了一系列研究。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为理解内体离子运输调控及相关疾病机制提供了重要线索。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先运用高分辨率复杂组分析技术（csBN-MS），结合天然凝胶电泳与定量质谱，研究蛋白复合物的组成；利用多表位亲和纯化结合质谱（meAP-MS），进一步确认蛋白间的相互作用；构建基因敲除小鼠模型，探究相关基因的功能；通过免疫共沉淀、免疫细胞化学、流式细胞术等技术，从不同角度分析蛋白的定位、表达及功能变化。

研究结果如下：

• TMEM9 蛋白是内体 CLC 的必需 β - 亚基：通过 csBN-MS 和 meAP-MS 技术，研究人员发现 TMEM9 和 TMEM9B 与 ClC-3、ClC-4 和 ClC-5 存在共组装现象。免疫共沉淀实验表明，TMEM9A 能与不同的 ClC-3 剪接变体、ClC-4 和 ClC-5 相互作用，且其跨膜结构域（TMD）对于结合 ClC-5 至关重要。基因敲除实验显示，Tmem9a^-/-和 Tmem9b^-/-小鼠单独敲除时无明显表型，但双敲除小鼠在胚胎期或出生后不久死亡，表明 TMEM9 蛋白具有关键生理功能。
• CLC 和 T9 蛋白相互依赖：T9A 或 T9B 的缺失会影响其 CLC 伙伴蛋白的水平，如在肾脏中，T9A 或 T9B 缺失会导致 ClC-4 水平大幅下降，ClC-5 的表达依赖于 T9B。反之，T9 蛋白的稳定性也依赖于 CLC，如 Clcn3 敲除会导致 T9A 蛋白大量减少。
• T9A 和 T9B 主要定位于内体：通过免疫细胞化学等方法，研究发现 T9A 和 T9B 与内体 ClC-3、ClC-4 和 ClC-5 共定位。在肾近端小管和骨髓来源的巨噬细胞中，T9A 和 T9B 与 ClC-5 在特定的内体结构中共定位，且 T9A 和 T9B 的定位与内体功能相符，尽管此前有研究认为它们主要定位于溶酶体，但该研究未发现其与 V 型 ATP 酶相关的证据。
• TMEM9 蛋白通过酸性簇调节 vCLC 运输：以 ClC-5 为研究对象，发现共表达 T9A 或 T9B 可抑制其电流，减少其表面表达。T9 蛋白 C 末端的酸性簇（pACs）在调节 vCLC/T9 复合物从质膜移除、促进其向内体运输中起重要作用，突变 pACs 可增加共表达的 HA-ClC-5 的质膜表达。
• T9 C 末端抑制域（CID）抑制 vCLC 离子通量：删除 T9 C 末端几乎完全可使共表达的 ClC-5 表面表达并产生电流，而特定的 T9 突变可解除对 ClC-5 电流的抑制，表明 T9 C 末端抑制 ClC-5 离子运输。在 ClC-3 过表达诱导的大泡形成实验中，T9A 或 T9B 共转染可抑制该过程，且抑制作用依赖于 T9 C 末端。
• T9 CID 与 vCLC 相互作用在调控和疾病中的作用：T9 蛋白对 CLC 离子运输的抑制可能涉及 CID 与 CLC 的直接相互作用。研究发现，疾病相关的 CLCN4 突变可使离子运输部分抵抗 T9 蛋白的抑制，导致有害的功能获得，引发疾病。此外，ClC-3 或 T9 蛋白上相关残基的磷酸化可能通过削弱 CLC/T9 相互作用来激活离子运输。
• 正确定位的 ClC-4 和 ClC-5 可导致空泡化：T9B 可将 ClC-5 从内质网运输到内体，使其形成空泡。而 ClC-4 需要与 ClC-3 形成异二聚体才能运输到内体，且运输缺陷的 ClC-3^td与 ClC-4 共表达也可产生空泡，表明 ClC-4 和 ClC-5 在正确定位到内体时，其过度活性也会导致空泡化。

研究结论和讨论部分指出，TMEM9A 和 TMEM9B 是 ClC-3 至 ClC-5 2Cl^-/H⁺交换器的必需 β - 亚基，对 CLC 蛋白的稳定性、运输和离子运输活性的调节至关重要。T9 蛋白通过 pACs 调节 vCLC 的定位，通过 CID 抑制 vCLC 的离子运输，这种抑制作用具有重要的生理意义，既能防止内体 2Cl^-/H⁺交换不受控制带来的有害影响，又能在抑制解除时大幅增加运输速率。该研究重新分类了一些与疾病相关的 CLCN3 和 CLCN4 变体，将其归为功能获得性突变。此外，不仅 CLCN3 和 CLCN4 突变，T9 基因突变也可能导致疾病。该研究揭示了内体 CLC 离子运输的调控机制，为理解内体 Cl^-和 H⁺运输的调控及其对生理和疾病的影响奠定了基础，对未来相关疾病的研究和治疗具有重要的指导意义。