通过 CCR5 基因敲除和 B 细胞分泌 HIV 抑制抗体构建多层级 HIV-1 抗性的造血干细胞和祖细胞疗法

《Nature Communications》：Multilayered HIV-1 resistance in HSPCs through CCR5 Knockout and B cell secretion of HIV-inhibiting antibodies

目前，HIV-1 感染治疗面临诸多难题，如 CCR5 基因敲除（KO）的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）异体移植供体稀缺、存在移植物抗宿主病（GvHD）风险且对 X4 嗜性病毒无效等。研究人员开展了通过自体移植经基因工程改造的 HSPCs 治疗 HIV-1 感染的研究，成功实现 CCR5 KO 和抗体表达盒敲入，工程化 HSPCs 可在体内定植并重建造血谱系，为 HIV-1 功能性治愈提供了新策略。

　　在全球范围内，艾滋病（AIDS）的阴影依旧笼罩，HIV 感染人数众多且治疗形势严峻。尽管小分子抗逆转录病毒疗法（ART）取得了进展，能控制病毒载量，但每天坚持服药的严格要求让许多患者难以长期维持治疗效果，2022 年仍有超 60 万人死于艾滋病相关疾病。目前，唯一已知能治愈 HIV-1 感染的方法 ——CCR5 基因敲除的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）异体移植，却因匹配供体稀少、移植相关疾病以及对部分 HIV-1 毒株无效等问题，无法广泛应用。在此背景下，科研人员迫切需要探索新的治疗方案，为 HIV-1 感染患者带来希望。

来自斯坦福大学医学院的研究人员开展了一项极具意义的研究，他们致力于通过一种创新的治疗策略，为 HIV-1 感染的治愈提供新途径。研究人员提出了一种一次性治疗方案，即通过对 HSPCs 进行体外基因工程改造，使其产生 CCR5 基因敲除细胞，同时让 B 细胞后代长期分泌有效的 HIV-1 抑制抗体，随后进行自体移植。这一研究成果发表在《Nature Communications》上，为 HIV-1 感染的治疗带来了新的曙光。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们利用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，对 HSPCs 进行精准的基因编辑。通过电穿孔导入核糖核蛋白（RNP），并借助腺相关病毒 6 型（AAV6）传递 DNA 供体模板，实现同源定向修复（HDR），从而达到 CCR5 基因敲除和抗体表达盒敲入的目的。此外，他们还使用了免疫缺陷小鼠模型，评估工程化 HSPCs 的定植和造血谱系重建能力。

研究结果主要如下：

• HIV-1 抑制抗体功能验证：研究人员选用多种已证实能抑制 HIV-1 的抗体，包括临床批准的 Ibalizumab 和多种广泛中和抗体（bNAbs）。为确保抗体在单转录本表达时的功能，他们采用肽接头连接抗体的重链和轻链。实验表明，多数抗体在连接肽接头后仍能保持功能，如 10-1074、Ibalizumab、PGDM1400 和 CAP256V2LS 等，仅 3BNC117 和 1-18 在连接肽接头后中和效力有所下降。这一结果证明了通过单转录本表达并使用肽接头连接抗体的可行性，为后续研究奠定了基础。
• CCR5 基因敲除和抗体表达盒敲入效率：在对 CD34⁺ HSPCs 进行编辑时，研究人员使用高效的单导向 RNA（sgRNA）和高保真的 Cas9 蛋白，实现了 CCR5 基因的高效敲除。同时，通过 AAV6 传递带有抗体表达盒的供体模板，成功将抗体表达盒敲入 CCR5 位点。敲入分析显示，单个抗体构建体平均可整合到 31%-41% 的等位基因中，10-1074 和 Ibalizumab 联合构建体的敲入率最高可达 44%。此外，使用小分子抑制非同源末端连接（NHEJ），可提高敲入效率，减少 AAV6 的使用量，且不影响细胞的分化能力和健康状态。这一发现为优化基因编辑效率提供了新的方法。
• 工程化 HSPCs 在体内的定植和重建能力：研究人员将编辑后的 CB CD34⁺细胞移植到免疫缺陷的 NSG 小鼠体内，结果显示工程化 HSPCs 能够成功定植，并在骨髓和脾脏中检测到人类细胞的嵌合现象。各编辑条件下，细胞在骨髓和脾脏中的造血谱系分布相似，表明编辑策略未引入重建偏差。然而，在定植终点时，敲入等位基因的频率有所下降。进一步研究发现，使用 AZD7648 处理并降低 AAV6 剂量，可提高敲入等位基因在体内的维持率，为提高工程化 HSPCs 的治疗效果提供了重要依据。
• 工程化 B 细胞分泌抗体的功能：由于免疫缺陷小鼠模型无法有效评估抗体分泌功能，研究人员对成人外周血 CD19⁺ B 细胞进行编辑。结果显示，编辑后的 B 细胞能够高效地将抗体表达盒敲入 CCR5 位点，并分泌具有功能的抗体。通过抗原特异性 ELISA 分析和 TZM-bl 感染试验，证实了分泌的抗体能够有效抑制 HIV-1 假病毒的感染，且多种抗体联合表达可增强抑制效果。这一结果表明，工程化 B 细胞具备分泌治疗性抗体的能力，为 HIV-1 感染的治疗提供了新的方向。

在研究结论和讨论部分，研究人员指出，通过对 HSPCs 进行基因工程改造，实现 CCR5 基因敲除和抗体表达盒敲入，为 HIV-1 感染的治疗提供了一种有前景的策略。与传统的抗体注射疗法相比，工程化 HSPCs 移植有望实现一次性治疗，且 B 细胞分泌的抗体可长期维持稳定的浓度，避免了传统疗法中抗体浓度的波动。此外，B 细胞分泌的抗体可能具有天然的翻译后修饰，有助于降低免疫识别和抗药抗体的形成。然而，目前的研究仍存在一些局限性，如免疫缺陷小鼠模型无法完全模拟人体环境，需要进一步开展体外模型和非人灵长类动物模型的研究，以评估治疗的安全性和有效性。未来，还需进一步优化编辑条件，确定 HSPCs 中敲入频率与抗体分泌的关系，探索可诱导系统对抗体水平的精确控制，以及评估混合链抗体形成对治疗的影响等。

总体而言，这项研究为 HIV-1 感染的治疗开辟了新的道路，为实现 HIV-1 的功能性治愈提供了重要的理论和实践基础，有望在未来改善 HIV-1 感染患者的治疗现状，推动相关领域的进一步发展。