结核分枝杆菌蛋白酶体核心颗粒变构调节的结构基础：解锁抗结核新疗法的关键

为探究结核分枝杆菌（Mtb）蛋白酶体系统机制并开发结核病治疗策略，研究人员对 Mtb 20S 核心颗粒（CP）开展研究。通过实验，他们发现其存在自抑制构象，明确了变构调节通路。这为开发靶向变构的抗结核疗法提供了理论依据。

　　在生命的微观世界里，蛋白质的代谢如同精密的交响乐，有条不紊地维持着细胞的正常运转。而在致病微生物结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的 “小宇宙” 中，蛋白酶体系统扮演着至关重要的角色，它如同忠诚的 “质检员”，负责选择性降解受损或错误折叠的蛋白质，对病菌在宿主内的生存起着决定性作用。因此，将 Mtb 的 20S 核心颗粒（20S core particle，20S CP）作为靶点，成为了研发结核病治疗药物的可行策略。

然而，目前关于 Mtb 20S CP 的研究仍存在诸多谜题。尽管已知其活性受到变构调节（allosteric regulation），但具体涉及的构象变化却从未在高分辨率结构中被清晰捕捉。就好比我们知道一辆车能变速行驶，却不清楚换挡时各个零件是如何运作的。这种知识上的空缺，严重阻碍了针对 Mtb 蛋白酶体的药物研发进程。为了填补这一空白，来自加拿大圭尔夫大学（University of Guelph）、麦吉尔大学（McGill University）等机构的研究人员展开了深入探索，相关研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员为解开 Mtb 20S CP 的神秘面纱，采用了多种先进技术。其中，单颗粒冷冻电镜（single-particle electron cryomicroscopy）能够在接近天然状态下对蛋白质结构进行高分辨率成像，就像给蛋白质拍高清 “冷冻照”；H/D 交换质谱（H/D exchange mass spectrometry，HDX-MS）则可以通过检测蛋白质中氢 / 氘的交换情况，精准分析蛋白质的动态结构变化，如同给蛋白质的动态变化装上了 “监测仪” 。

研究结果如下：

• Mtb 20S CP 呈现变构酶动力学特征：研究人员构建并纯化了多种 Mtb 20S CP 变体，通过检测它们对不同底物的水解活性，发现 Mtb 20S CP 在底物降解过程中表现出正协同性（positive cooperativity）。以 Z-VLR-AMC 为底物时，野生型（20S_WT）和不同变体的水解曲线呈 S 形，表明 β 亚基之间存在正协同作用。例如，20S_OG变体相较于 20S_WT，Hill 系数增加，K_0.5值降低，这意味着去除门控残基后，协同相互作用增强。同时，利用 11 - 残基底物 LF2 实验发现，20S_OG能成功降解该底物，而 20S_WT则不能，进一步验证了门控功能对底物降解的影响。此外，通过抑制剂实验，发现伊沙佐米（ixazomib）能有效抑制 20S_WT的肽酶活性，且其抑制作用呈现剂量依赖性，这些结果充分证明 Mtb 20S CP 是一个变构系统。
• Mtb 20S CP 存在自抑制构象：借助冷冻电镜技术，研究人员成功解析了四种 Mtb 20S CP 变体的近原子分辨率三维结构。在 20S_βT1A变体结构中，他们发现 β 亚基上的一对螺旋（开关螺旋 I 和 II）发生了显著构象变化。其中，开关螺旋 I 的位移导致 S1 口袋完全关闭，底物结合能力丧失，这是一种全新发现的自抑制构象。而在伊沙佐米结合的 20S_WT变体中，清晰观察到抑制剂与活性位点的结合模式，其结合方式与已知的蛋白酶体抑制剂机制相符。
• 双向变构通路调节 Mtb 20S CP 活性：HDX-MS 实验结果显示，伊沙佐米结合、βT1A 突变以及门控残基缺失等因素，均会引起 20S CP 不同区域的氘摄取变化。这些变化表明，存在一条双向变构通路，它连接着 α 和 β 亚基，通过调节开关螺旋 I 和 II 的构象，进而影响 20S CP 催化三联体的活性。例如，伊沙佐米结合导致 β 亚基多个区域的氘摄取减少，包括催化残基和开关螺旋区域；βT1A 突变则引起 α 和 β 亚基多个肽段的氘摄取变化，且这种变化范围比伊沙佐米结合时更广泛。
• Mtb 20S 在慢时间尺度上于经典静息态和自抑制态间相互转换：对 HDX-MS 数据的深入分析发现，部分肽段呈现出不对称的同位素分布，这暗示着 20S CP 存在缓慢相互转换的构象状态。3DVA 分析进一步证实了这一点，在 20S_βT1A变体中观察到开关螺旋 I 和 II 的构象变化，从初始的无序状态逐渐转变为与经典静息态相似的有序状态，这表明野生型 20S CP 在自然反应周期中也会出现这种构象转换。
• 突变引发 Mtb 20S CP 变构群体转移：研究人员通过计算不同构象间的偏差，针对性地对 α 和 β 亚基进行单残基突变。实验结果表明，这些突变能够调节 20S CP 的催化功能。如 αQ98K 突变可稳定自抑制构象，降低 V_max值；而 βV53Q 等突变则能增强活性。同时，通过脉冲 HDX-MS 和底物降解实验，进一步验证了这些突变对 20S CP 结构、动力学以及降解底物能力的影响。

在讨论部分，研究人员指出，尽管此前已有关于 Mtb 20S CP 的研究，但此次发现的自抑制构象为理解其功能提供了新视角。虽然研究过程中因 Mpa 与 20S CP 的弱相互作用，使得探究氨基酸突变对 Mpa 介导的底物降解影响变得复杂，但研究采用短肽底物直接检测蛋白酶体活性的方法，为 20S CP 的变构调节提供了确凿证据。该研究在结构上的新发现，有助于理解 Mtb 20S CP 的功能动态，为未来开发针对 Mtb 20S CP 变构位点的抑制剂提供了重要理论基础。并且，这种变构调节机制在其他结构同源系统中可能也存在，虽然还需进一步实验验证，但该研究成果无疑为相关领域的研究开辟了新方向，使我们对 Mtb 蛋白酶体系统的认识更上一层楼，朝着攻克结核病的目标又迈进了坚实的一步。