Design and implementation of aerobic and ambient CO2? -reduction as an entry-point for enhanced carbon fixation：开启生物固碳新征程

《Nature Communications》：Design and implementation of aerobic and ambient CO2-reduction as an entry-point for enhanced carbon fixation

在生物固碳研究中，为解决现有 “还原优先” 策略受厌氧条件限制等问题，研究人员开展了合成代谢途径的设计与实现研究。他们构建了 CORE 循环，可在有氧及环境CO2?水平下将CO2?转化为甲酸盐，为增强CO2?固定提供新途径。

　　在全球碳循环中，生物将无机碳转化为生物质意义重大，以二氧化碳（CO2?）作为主要碳源建立可持续（生物）经济，是科研人员一直以来努力的方向。目前，从CO2?形成生物质主要有 “碳固定” 和 “还原优先” 两种策略。“还原优先” 策略虽在能量效率和速率方面有优势，但仅存在于厌氧生物中，且依赖低氧化还原电位电子供体，在高CO2?分压下才能发挥作用 。而许多生物生产宿主，尤其是包括作物在内的光合生物，都局限于有氧环境和大气CO2?水平。这就引出了一个关键问题：“还原优先” 路线能否在有氧条件下实现？
为了解决这一问题，来自马克斯?普朗克陆地微生物研究所等多个研究机构的研究人员展开了深入研究。他们成功设计并实现了一种名为 CORE 循环（CO2? -reduction cycle）的合成代谢途径，该研究成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员运用了多种关键技术方法。在酶筛选和鉴定方面，通过高通量体外生物勘探来识别合适的酶候选物，并对其进行生化表征；在体内实验中，采用模块化策略在大肠杆菌中逐步组装和测试 CORE 循环的各个模块；为了优化循环，利用自适应实验室进化（ALE）来调整酶的活性和代谢通量；最后，借助通量平衡分析（FBA）评估 CORE 循环在不同场景下的性能。
研究结果如下：

• 设计并评估耐氧、依赖 NAD (P) H 的CO2?还原途径：研究人员理论上设计了十种不同的假设途径，通过比较资源需求、途径长度、对复杂酶辅因子的需求以及新酶反应的数量等多个标准，筛选出四个有前景的设计，其中包括后来构建成 CORE 循环的 β- 酮酸裂解循环。
• 体外原型设计确定 CORE 循环：针对四个有前景的循环中缺失的新反应，研究人员进行文献检索和酶候选物测试。最终成功证明了 β- 酮酸裂解反应，从而确定实现完整的 β- 酮酸裂解循环，即 CORE 循环。该循环能将CO2?（碳酸氢盐）净转化为甲酸盐，同时消耗 1 个 ATP 和 1 个 NADPH 。
• 鉴定和深入表征 CORE 循环的酶候选物：除了 β- 酮酸裂解酶（BKACE）反应，CORE 循环的其他反应在自然途径中已为人熟知。研究人员对各反应的酶候选物进行体外测试，确定了合适的酶。对于 BKACE 反应，从 124 种酶中筛选出 20 多种具有所需活性的同源物，并对其中 8 种进行详细表征，发现来自反硝化副球菌的 BKACE15 表现最佳。
• 体内模块化实现 CORE 循环：研究人员采用模块化策略在大肠杆菌中实现 CORE 循环。首先构建了能检测甲酸盐的大肠杆菌菌株，验证了模块 4 的功能；接着测试模块 2，通过共表达 β- 丙氨酸：丙酮酸转氨酶（BPT）为 BKACE 反应提供底物，证实了模块 2 的活性；随后添加模块 1，表达丙二酸单酰辅酶 A 还原酶（MCR），实现了模块 1、2 和 4 的共同运作。但此时菌株仍无法以乙酰乙酸为主要碳源生长。
• 自适应实验室进化实现完整 CORE 循环：研究人员通过 ALE 策略，逐渐使菌株摆脱对甲酸盐的依赖，实现了以乙酰乙酸为碳源的生长。经过长期进化，分离出的克隆菌株生长速率显著提高，验证了完整 CORE 循环在进化后的大肠杆菌菌株中的运作。
• 解析进化生长的遗传基础：对非进化祖先和进化克隆菌株进行基因组和质粒重测序，发现与 CORE 循环相关的两个关键酶 MCR 和 AtoA 发生了突变。MCR 基因存在野生型和突变体的混合测序 reads，突变导致其活性降低，但一定程度的活性降低有助于体内 CORE 循环的运作；AtoA 基因的突变改变了其底物特异性或活性，使其能更好地与 CORE 循环整合。
• 评估 CORE 循环的潜在应用：利用 FBA 分析，发现 CORE 循环与光合作用的卡尔文 - 本森 - 巴斯姆（CBB）循环结合时，可以替代或补充自然光呼吸，提高碳效率；与不同的下游甲酸盐同化途径结合，在合成自养方面，其生物质产量优于 CBB 循环。
  研究结论表明，CORE 循环作为一种人工、模块化的代谢途径，可在有氧和大气CO2?水平下将CO2?转化为甲酸盐，为细胞提供足够的 C1 单位和丝氨酸，使工程化大肠杆菌的倍增时间达到约 4 小时。当与下游甲酸盐同化途径结合时，CORE 循环为基于CO2?的生物生产开辟了新的可能性。此外，作为光呼吸旁路，它有可能提高光合作用的产量。与最近提出的合成 4 - 羟基 - 2 - 氧代丁酸（HOB）循环相比，CORE 循环能产生游离的 C1 分子，在下游同化策略方面更具灵活性。总之，该研究为 “还原优先” 的CO2?固定策略提供了一种耐氧替代方案，为未来增强或取代自然和合成的CO2?固定提供了多种机会。