一种毒素 - 抗毒素系统通过 DNA 损伤与修复实现噬菌体防御：机制新探与功能解析

《Nature Communications》：A toxin-antitoxin system provides phage defense via DNA damage and repair

为探究毒素 - 抗毒素（TA）系统的抗噬菌体机制，四川大学研究人员对 ShosTA 系统展开研究。结果表明，ShosT 干扰嘌呤代谢引发细胞死亡，ShosA 协助 DNA 修复拮抗其毒性，T7 噬菌体 Gp0.7 可触发该系统。这为理解 TA 系统抗噬菌体免疫提供新视角。

　　在微观的细菌世界里，一场场看不见的 “战争” 时刻都在发生，噬菌体与细菌之间的博弈从未停止。毒素 - 抗毒素（Toxin-Antitoxin，TA）系统广泛存在于细菌和古菌中，以往研究发现它似乎在这场 “战争” 中扮演着重要角色，参与噬菌体防御，可具体机制却一直像被迷雾笼罩，充满争议。比如，虽然知道质粒编码的 TA 系统能维持质粒在细菌群体中的存在，被称为 “质粒成瘾”，但染色体编码的 TA 系统生物学功能却难以捉摸。而且，不同类型 TA 系统对抗噬菌体的方式也大不相同，这些都吸引着科研人员不断探索。为了揭开这些谜团，四川大学的研究人员挺身而出，踏上了探索之旅。他们聚焦于一种 IV 型 TA 系统 ——ShosTA，试图弄清楚它究竟是如何发挥抗噬菌体作用的。最终，他们的研究成果发表在了《Nature Communications》上，为我们理解细菌与噬菌体的斗争机制打开了新的大门。
研究人员主要运用了结构生物学、生物化学以及代谢组学等技术。在结构生物学方面，通过 X 射线晶体学技术测定 ShosT 和 ShosA 的晶体结构；生物化学技术用于分析蛋白的酶活性、蛋白 - 蛋白相互作用以及蛋白 - DNA 相互作用；代谢组学技术则借助 UPLC - ESI - Q - Orbitrap MS 系统对代谢物进行分析，以此来探究 ShosT 对细菌代谢途径的影响 。

ShosTA 系统提供针对噬菌体的防御

研究人员将大肠杆菌 APEC O1 的 shosA 和 shosT 基因，在其天然启动子的控制下，导入原本不含这些基因的大肠杆菌 BL21 (DE3) 中。随后用一系列噬菌体去感染含有 ShosTA 系统的菌株，发现该系统能显著保护大肠杆菌免受 T7 噬菌体的侵害，使 T7 噬菌体的铺板效率降低了 6 个数量级。进一步研究发现，ShosTA 系统可能通过流产感染（Abi）机制发挥作用，高感染复数（MOI = 2）时，含有 ShosTA 系统的细菌群体生长会被抑制。而且，通过菌落形成实验证实了 ShosT 是毒素，ShosA 是抗毒素，二者共同构成功能性 TA 系统。

ShosT 的晶体结构和酶活性

由于 ShosT 的毒性，单独在大肠杆菌中表达较为困难，研究人员便将其与 ShosA 共表达并纯化。通过 X 射线晶体学技术，测定了 ShosT 在 1.7 ? 分辨率下的晶体结构，发现它由 N 端水解酶结构域（1 - 164 位氨基酸残基）和 C 端磷酸核糖转移酶（PRTase）结构域（165 - 424 位氨基酸残基）组成。N 端水解酶结构域具有典型的 Rossmann 折叠核心，与 III 型可溶性无机焦磷酸酶（PPase）具有明显的同源性，并且 ShosT 在体外表现出不依赖 Mg^{2 +}的焦磷酸酶活性。C 端 PRTase 结构域也采用典型的 Rossmann 折叠，与腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APRTase）高度相似，含有三个典型的 PRPP 结合环。研究人员通过定点突变实验证实，PRTase 在介导细胞死亡中起主导作用，PPase 对 PRTase 介导的细胞死亡起正向调节作用。

ShosA 的晶体结构和 DNA 结合能力

为了解 ShosA 中和毒性的功能，研究人员测定了 ShosA 截短体（1 - 313 位氨基酸残基，不含 C 端无序环）在 2.0 ? 分辨率下的晶体结构。ShosA 与 DNA 加工蛋白 A（DprA）具有明显的同源性，采用 N 端无菌 α 基序（SAM）结构域和 C 端 Rossmann 折叠结构域的双结构域架构。通过电泳迁移率变动分析（EMSA）发现，野生型 ShosA 及其 C 端截短突变体均具有单链 DNA（ssDNA）结合能力，而电荷反转突变体则丧失了这种能力，说明 ShosA 的 DNA 结合能力在中和 ShosT 细胞毒性中起关键作用。

ShosT 干扰嘌呤代谢损害基因组复制

为阐明 ShosT 细胞毒性的机制，研究人员进行了非靶向代谢组学分析。在 ShosT 毒性导致细胞生长下降前 10 分钟收集细胞，以确保代谢组的变化仅来自 ShosT 而非后续的细胞死亡。结果发现，ShosT 主要影响嘌呤代谢，干扰嘌呤代谢会破坏细胞核苷酸池，进而导致 DNA 损伤和细胞丝状化。通过荧光显微镜观察和基因组测序分析，证实了 ShosT 表达会使大肠杆菌细胞出现丝状化形态并积累 DNA 重复。

ShosA 有助于消除基因组重复

ShosA 含有 SAM 结构域，通常参与蛋白质 - 蛋白质相互作用。通过免疫沉淀结合串联质谱（IP - MS/MS）分析，研究人员发现 ShosA 与五种重组相关蛋白相互作用，包括 RdgC、RecJ、RarA、XerD 和 RecN。这表明 ShosA 可能通过同源重组消除 ShosT 诱导的基因组重复，从而中和 ShosT 的毒性。研究人员设计了含有毒素基因 ccdB 的构建体进行验证，结果发现 ShosA 能够拯救部分大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞免受 ccdB 的毒性，说明 ShosA 可能通过同源重组促进毒素基因的删除。

鉴定 ShosTA 防御系统的噬菌体触发因子

先前研究发现了逃逸 T7 噬菌体中三个可能触发 ShosTA 系统的突变基因，编码单链 DNA 结合蛋白（SSB）、宿主 RNA 聚合酶抑制剂（Gp0.7）和引发酶 - 解旋酶。研究人员通过共表达实验发现，T7 噬菌体的 Gp0.7 与 ShosTA 共表达会导致细胞完全死亡，而 T7 噬菌体的 SSB 与 ShosTA 共表达则未显示出明显的细胞毒性，表明 Gp0.7 是 ShosTA 防御系统的触发因子。进一步研究发现，Gp0.7 可能通过抑制宿主转录，阻碍抗毒素 ShosA 的持续合成，同时由于 ShosA 的内在不稳定性，导致其蛋白水平下降，从而释放 ShosT 的毒性。
在这场细菌与噬菌体的 “战争” 中，研究人员对 ShosTA 系统的深入探究，为我们揭示了一种全新的毒素 - 抗毒素抗噬菌体免疫机制。ShosTA 系统作为一种 IV 型 TA 系统，其毒素 ShosT 通过干扰嘌呤代谢诱导 DNA 复制异常、细胞丝状化和细胞死亡，抗毒素 ShosA 则通过促进 DNA 损伤修复来拮抗 ShosT 的毒性。T7 噬菌体的 Gp0.7 成为触发这一系统的关键因素，打破了毒素 - 抗毒素的平衡，启动了细菌的防御机制。
然而，研究也留下了一些待解之谜。比如 ShosT 介导细胞毒性和 ShosA 介导同源重组的详细机制仍不明确，ShosT 的生理底物究竟是什么，ShosA 招募了哪些效应蛋白以及它们如何协同消除 DNA 重复等问题，都需要后续进一步研究。但无论如何，这项研究为我们理解细菌的抗噬菌体防御机制提供了重要的理论基础，也为未来开发新型抗菌策略和基因编辑工具提供了潜在的方向。它就像一颗启明星，照亮了我们在细菌与噬菌体相互作用领域的探索之路，激励着科研人员不断前行，去揭开更多微观世界的奥秘。