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本文聚焦生长素响应因子（ARF），通过研究其与 DNA 的结合界面，发现该界面在进化中高度保守。ARF 作为生长素信号传导的关键效应器，其 DNA 结合特性的保守性对理解生长素调控基因表达机制意义重大，值得科研人员深入研读。
### 研究背景
生长素（auxin）作为植物信号分子，在植物发育进程中扮演着关键角色，其作用主要通过核生长素途径（NAP）实现。该途径包含 TIR1/AFB 受体、Aux/IAA 共抑制子以及最终效应器 —— 生长素响应因子（Auxin Response Factor，ARF）家族这三类蛋白 。在低生长素水平时，Aux/IAA 与 ARF 结合并抑制其活性；当生长素浓度升高，生长素促使受体与共抑制子形成复合物，使共抑制子失稳，ARF 得以释放并行使转录功能。而基因能否响应生长素，取决于启动子中是否存在特定的顺式作用元件 —— 生长素响应元件（Auxin Response Elements，AuxRE）。
ARF 包含 DNA 结合域（DNA-Binding Domain，DBD）、中间区域（Middle Region，MR）和 Phox and Bhem 1（PB1）域三个主要结构域。其中，DBD 决定了 ARF 对 AuxRE 的特异性，它又可细分为二聚化域（Dimerization Domain，DD）、B3 域和辅助域（Ancillary Domain，AD）。ARF 的 B3 域能与 DNA 中的 AuxRE 直接结合，一般由 TGTCNN 元件构成，其中 TGTC 为保守核心。
ARF 起源于链形植物共同祖先，在进化过程中发生多次基因复制事件。早期形成 AB-ARF 和 C-ARF 两个分支，之后 AB-ARF 又进一步分化为 A - 和 B - 类 ARF。不同类别的 ARF 虽结构相似，但功能存在差异。A - 和 B - 类 ARF 在体内 DNA 结合偏好部分相似，而 C - 类 ARF 结合特性独特，功能可能与生长素信号传导无关。目前，ARF 家族在进化过程中，其蛋白质 - DNA 界面的变化程度及对新功能的适应机制尚不清楚，这也成为本研究的切入点。
研究结果
- ARF 的 DNA 结合残基和 B3 域的保守性：通过对不同物种 ARF 与 AuxRE 结合情况分析，发现 ARF 与 AuxRE 存在广泛相互作用，且都能结合 TGTCNN 元件，这暗示 DNA 结合残基应具有高度保守性。研究人员借助高分辨率的 AtARF1 结构（PDB: 6YCQ），重新审视 ARF-AuxRE 界面，发现除直接相互作用外，还存在由水分子介导的氢键和水网络等相互作用。利用 ConSurf 分析 AtARF1 结构中各残基的保守性，结果显示 B3 域残基的保守性远高于 DBD 其他区域，其中 DNA 结合残基的保守性尤为突出。
对多形性地钱（Marchantia polymorpha）三种 ARF（MpARF1、MpARF2 和 MpARF3）的蛋白质结构预测表明，关键 DNA 结合残基在三维结构中的位置完全相同，说明所有 ARF 的 B3 域折叠方式高度相似。在多形性地钱自然群体和拟南芥等植物的 ARF 基因中检测发现，ARF DNA 结合残基变异极少，仅在部分可能发生亚功能化、新功能化或假基因化的旁系同源基因中出现变异，这进一步证明 ARF DNA 结合特异性受到强大的进化压力。
2. 多形性地钱唯一 A 类 ARF 的功能依赖于核心 TGTC 结合残基：为探究 AuxRE 结合残基的生理相关性，研究聚焦于多形性地钱唯一的 A 类 ARF——MpARF1。对野生型（Tak-1）和 MpARF1 缺失突变体（Mparf1-4）进行转录组测序分析，结果显示，在去除内源生长素后，野生型植株经生长素（IAA）处理会出现 112 个差异表达基因，而突变体对生长素无响应，这表明 MpARF1 是多形性地钱中生长素诱导转录的主要效应器。
通过对 MpARF1 关键 DNA 结合残基进行丙氨酸替换突变，并利用互补实验检测突变体对 Mparf1-4 表型的互补情况。结果发现，R194A、P197A 和 R199A 突变体无法互补 Mparf1 的表型，说明这些残基对 MpARF1 的生理功能至关重要；而 H146A 和 Q196A 突变体能够完全互补，表明这两个残基并非功能必需。进一步研究发现，Q196A 突变体能够保留与 DNA 的相互作用，H146 虽在体外对结合高亲和力的 TGTCGG 元件至关重要，但 H146A 突变体在体内却能完全互补，且突变蛋白的表达和细胞定位不受影响。
3. TGTC 结合残基的自然变异损害 MpARF1 的功能：鉴于 ARF DNA 结合的高度保守性，关键 DNA 接触残基的有限变异可能影响 DNA 结合特性。研究人员对一系列 ARF 变异体进行功能评估，发现 R194 和 R199 与 AuxRE 存在广泛相互作用，C 类 ARF 中这些残基的变异（如 R199E）会破坏 AuxRE 结合，导致无法互补 Mparf1 表型。尝试用理化性质相似的赖氨酸替代 R194 和 R199，结果 R194K 和 R199K 也无法互补，说明其他氨基酸难以替代这两个精氨酸在 AuxRE 结合中的功能。对于 Q196，Q196K 和 Q196R 突变体能够互补，表明该残基可容忍其他长链极性氨基酸。而基于 C 类 ARF 进行的 P197Q 和 P197R 替换突变体无法互补，说明该位置不能容忍极性残基。通过分子对接模拟发现，R194 和 R199 变异后，与 DNA 的结合能力显著下降，进一步证实它们对 ARF DNA 结合的关键作用，同时表明 Q196 可能具有与 DNA 结合无关的其他功能，且 ARF-DNA 界面受到强烈的纯化选择。
4. ARF-DNA 界面中的单个可调节残基：在 ARF-DNA 界面中，A 类和 B 类 ARF 中保守的组氨酸在 C 类 ARF 中被甘氨酸取代。MpARF1-H146 虽不结合核心 TGTC 位点，但被认为影响对 TGTCNN 元件中 N5 和 N6 的亲和力。研究人员对该位点的自然变异（H146G/N/S/Y）及一系列人工突变（H146A、H146F、H146Q、H146E）进行功能研究，发现除 H146E 突变体外，其他变异体均能不同程度地互补 arf1 突变体表型，恢复植株生长、发育及对生长素的响应。其中，H146G 变异体虽能在多个方面互补，但产生的芽孢杯数量少于野生型，暗示该位点组氨酸和甘氨酸在 ARF-DNA 界面可能存在功能差异，说明 MpARF1-H146 对生物学功能至关重要，同时又允许一定程度的氨基酸变异。
5. B3 域功能在陆地植物中保守：由于 ARF 关键 DNA 结合残基高度保守且对生理功能至关重要，研究人员推测远缘相关 ARF 的同源 DNA 结合界面应具有功能互换性。将拟南芥 A 类 ARF 的 B3 域替换多形性地钱 MpARF1 的 B3 域，结果显示所有替换后的版本都能完全互补 Mparf1 表型，表明这些 ARF 自陆地植物共同祖先分化后，B3 域仍保留了祖先功能。
多形性地钱中，A 类和 B 类 ARF 在 DNA 结合上存在竞争关系，源于它们相似的 DNA 结合特异性。研究发现，替换 MpARF1 的 B3 域为 MpARF2 的 B3 域能够完全互补 Mparf1 突变体表型，而替换为 MpARF3 的 B3 域则互补效果不佳，这表明 MpARF1 和 MpARF2 的 B3 域功能相似，而 MpARF3 的 B3 域功能不同。
进一步用藻类 ARF 的 B3 域替换 MpARF1 的 B3 域进行实验，发现部分藻类 ARF 的 B3 域能够部分互补 Mparf1 表型，暗示祖先 AB-ARF 与现存陆地植物 A/B 类 ARF 功能相似。同时，通过对 Mparf3 突变体进行 B3 域替换互补实验，发现 C 类 ARF 的 DNA 结合偏好与 AB 类和祖先 ABC 类存在差异，C 类 ARF 从祖先 ABC 类状态发生了分化，而 AB 类部分保留了祖先状态。
研究讨论
生长素依赖的基因调控对植物生长发育至关重要，ARF 蛋白与 DNA 的结合界面在生长素依赖的基因表达特异性中起关键作用。本研究通过转录组分析确定 MpARF1 是多形性地钱中生长素信号转导的主要转录因子，是研究 A 类 ARF 核心功能的良好模型。
对 ARF1 的 B3 域进行替换实验发现，MpARF1 和 MpARF2 的 B3 域可完全互换，差异可能存在于 DD-AD 域；MpARF3 的 B3 域虽能部分互补，但与前两者存在差异，这证实 A - 和 B-ARFs 保留了祖先 AB-ARF 的 DNA 结合特异性，且存在竞争结合关系。
ARF B3 域在整个链形植物谱系中高度保守，其 DNA 结合残基突变会损害 MpARF1 的生物学功能，这解释了为何 DNA 结合残基变异仅出现在 ARF 家族扩张的物种中。ARF 家族在获得新的 DNA 结合能力方面可能存在局限，部分发生 DNA 结合残基突变的 ARF 可能会快速假基因化，但也不排除在特定环境下获得新功能的可能性，这有待进一步研究。
B3 域替换实验为 ARF DNA 结合偏好的进化提供了线索，原始 AB-ARF 的 DNA 结合偏好可能在现存的 AB 类 ARF 中得以保留。然而，本研究存在一定局限性，如仅对多形性地钱的部分 ARF 进行了测试，未完全排除其他因素对实验结果的影响等。未来研究可通过更多实验深入探究不同类 ARF 的 DNA 结合偏好，完善对 ARF-DNA 界面进化的理解。
综上所述，本研究通过计算和遗传分析揭示了 ARF 蛋白 - DNA 界面的高度保守性，为解释生长素信号在陆地植物生长发育中的保守作用提供了重要依据。
