卤键催化 DNA 核酸内切酶的设计：打破传统金属催化局限，开启合成分子生物学新篇

为拓展生物催化剂种类，研究人员开展关于卤键（X-bond）能否替代小鼠核酸内切酶 G（mEndoG）中镁（Mg2+）辅因子的研究。结果发现卤代酪氨酸形成的氢键增强卤键可催化反应，该研究为设计新型酶活性位点提供思路。

　　化学领域的一个基本概念是元素的性质具有周期性。镁是酶中普遍存在的碱土（第 II 族元素）金属辅因子，可催化包括 DNA 加工在内的许多生化反应。研究表明，DNA 核酸内切酶中的催化 Mg²⁺可以在功能上被卤代酪氨酸的碘或氯（第 XVII 族元素）取代。这种非天然氨基酸形成氢键增强的卤键，使 DNA 主链易于水解，其机制与 Mg²⁺类似但又有所不同。这种独特的催化中心为合成分子生物学领域设计新型酶活性位点开辟了道路，还可能对生物学中金属催化剂的基本定义构成挑战。在本研究中，研究人员通过实验表明卤键（X-bond）可以在功能上替代小鼠核酸内切酶 G（mEndoG）中的镁（Mg²⁺）辅因子，从而拓展了生物催化剂的种类。研究人员将mEndoG 中与金属配位的谷氨酸 E136 突变为间卤代酪氨酸（^mXY，X = 氯或碘），构建出了既具有酸催化又具有碱催化特性的^mXY-mEndoG。在碱性条件下，金属螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）会使该酶失活，这表明卤素取代基促进了酪氨酸羟基的去质子化，从而可以招募 Mg²⁺来恢复依赖金属的催化中心。在低 pH 条件下，^mXY-mEndoG 对 EDTA 失活具有抗性，并且碘化构建体的活性明显高于氯化类似物。这些结果表明，氢键（H-bond）增强的卤键是^mXY-mEndoG 中的催化剂，天冬酰胺 N103 作为氢键供体，将组氨酸 H104 的质子化状态传递给卤素。突变研究以及对质子化和未质子化的^mXY???N103???H104 系统与野生型 Mg²⁺配位络合物模型的静电势（ESP）计算结果支持了这一模型。因此，研究人员通过颠覆生物化学中金属催化剂的构成，设计并构建了一种在活性位点使用非天然催化剂的酶 —— 催化卤键酶（cX-Zyme）。