CRISPR-Cas9 介导的原代人背根神经节神经元基因编辑：开启感觉疾病治疗新征程

《Scientific Reports》：Genetic editing of primary human dorsal root ganglion neurons using CRISPR-Cas9

为解决传统病毒载体递送 CRISPR-Cas9 治疗神经系统疾病时存在的神经毒性及转染效率低等问题，研究人员开展了原代人背根神经节（hDRG）神经元非病毒转染 CRISPR-Cas9 编辑的研究。结果显示成功实现基因编辑，该成果为感觉疾病治疗提供新方法。

　　在生物医学的广阔领域中，基因编辑技术一直是探索生命奥秘、攻克疑难病症的关键利器。CRISPR-Cas9 技术自问世以来，凭借其高效精准的基因编辑能力，在多个研究领域大放异彩，尤其在人类疾病治疗方面展现出巨大潜力，为攻克诸如镰刀状细胞病、β- 地中海贫血等顽疾带来了新希望。然而，当这一技术应用于神经系统疾病治疗时，却遭遇了重重阻碍。神经元结构和功能的特殊性，使得传统的病毒载体递送方式难以施展拳脚。病毒载体虽能将特定基因序列带入细胞，但却伴随着神经毒性，不仅影响神经元的正常功能，还在临床试验和非人类灵长类动物的临床前研究中引发了诸多问题，严重限制了 CRISPR-Cas9 技术在神经系统疾病治疗中的应用。

为了突破这一瓶颈，来自美国德克萨斯大学西南医学中心（University of Texas Southwestern Medical Center）、德克萨斯大学达拉斯分校（University of Texas at Dallas）等机构的研究人员勇挑重担，开展了一项极具创新性的研究。他们将目光聚焦于原代人背根神经节（hDRG）神经元，旨在开发一种非病毒载体的 CRISPR-Cas9 编辑方法，为神经系统疾病的治疗开辟新途径。最终，他们成功建立了一种可靠的、靶向特异性的非病毒 CRISPR-Cas9 介导的原代人神经元基因编辑方法，这一成果发表在《Scientific Reports》上，为感觉疾病的治疗带来了新的曙光。

研究人员在这项研究中主要运用了以下几种关键技术方法：首先，从器官捐赠者获取 hDRG 样本，精心制备原代神经元培养物；接着，采用阳离子脂质体转染法，利用 Lipofectamine 3000 将携带报告标签（GFP 或 mCherry）的 CRISPR-Cas9 质粒导入 hDRG 神经元；然后，借助 T7 核酸内切酶 I 检测、免疫细胞化学、蛋白质免疫印迹以及荧光成像板读数器（FLIPR）系统等技术，分别在基因组、蛋白质和功能水平对基因编辑效果进行验证 。

下面来看具体的研究结果：

• CRISPR-Cas9 转染方案及在人 DRG 培养物中的可行性：研究人员从 13 名器官捐赠者获取腰椎和胸部 DRG，制备 hDRG 培养物。选择瞬时受体电位香草酸 1 通道（TRPV1）作为首个研究靶点，使用 Lipofectamine 3000 进行阳离子脂质转染，将 CRISPR 质粒导入细胞。通过调整质粒 DNA 和 Lipofectamine 3000 的用量，优化转染条件，并发现年长捐赠者的神经元产量较低，因此设定 50 岁为年龄上限以保证培养神经元的产量和存活率。
• 用报告标签和 T7 核酸内切酶 I 检测验证 CRISPR-Cas9 转染：通过细胞活力 MTS 检测发现，细胞暴露于质粒 / 脂质复合物的时间不宜超过 24 小时。荧光活细胞成像显示，转染 TRPV1 gRNA 的细胞中 mCherry 报告标签的表达效率超过 60%，神经元转染效率为 77%，整个培养物转染效率为 63%，证明脂质转染法可成功将 DNA 质粒导入原代 hDRG 培养细胞。T7 核酸内切酶 I 检测结果表明，成功对 TRPV1 基因进行了 DNA 编辑，基因修饰率达 44%。
• CRISPR-Cas9 处理的 hDRG 神经元蛋白质表达的变化：免疫细胞化学和蛋白质免疫印迹结果显示，与阴性对照细胞相比，转染 5 天后，hDRG 培养物中 TRPV1 蛋白表达显著降低，神经元中 TRPV1 蛋白荧光强度降低 70%，整体裂解物中 TRPV1 表达降低 50%，证明成功编辑并降低了 hDRG 培养物中 TRPV1 蛋白的表达。
• hDRG 神经元中 TRPV1 基因敲除后功能表达降低：利用荧光成像板读数器检测细胞内 Ca²⁺水平变化，结果显示，与阴性对照孔相比，TRPV1 编辑孔对 800nM 辣椒素的反应显著降低，表明 CRISPR-Cas9 编辑 TRPV1 基因导致转染 3 天后功能性受体活性降低 。
• hDRG 培养物中 NTSR2 和 CACNA1E 的 CRISPR-Cas9 基因编辑：选择 G 蛋白偶联受体神经降压素受体 2（NTSR2）和 R 型电压门控钙通道 Cav2.3（CACNA1E）作为另外两个编辑靶点，转染含 GFP 报告标签的质粒后，二者的转染效率分别约为 60% 和 50%。通过 T7 核酸内切酶法验证了基因编辑，基因编辑率分别为 47% 和 46.3%。蛋白质免疫印迹和免疫细胞化学结果表明，NTSR2 和 Cav2.3 的蛋白表达显著降低。

研究结论和讨论部分意义重大。研究人员成功建立了原代人 DRG 培养物中基于非病毒脂质的 CRISPR-Cas9 基因组编辑方法，这一方法为直接在人感觉神经元中评估基因和相关蛋白功能提供了有力工具，有助于筛选作用于人感觉神经元的药物，为治疗顽固性疼痛等感觉疾病奠定了基础。同时，该研究也为未来 CRISPR-Cas9 技术在神经系统疾病治疗中的应用提供了重要参考，有望推动相关领域的进一步发展。