筛选与验证黄蜀葵实时荧光定量 PCR 最佳内参基因：开启次生代谢调控研究新篇

为解决黄蜀葵（Abelmoschus Manihot）缺乏有效基因表达检测系统，无法筛选实时荧光定量 PCR（qPCR）内参基因的问题，研究人员开展了筛选并克隆 11 个候选内参基因，评估其表达稳定性的研究。结果显示 eIF 和 PP2A1 稳定性最高，该研究为黄蜀葵功能基因分析等奠定基础。

　　黄蜀葵是一种集药用与食用价值于一身的植物，在我国有着悠久的栽培历史。它富含多种营养成分，尤其是黄酮类化合物和多糖，这些成分不仅在治疗慢性肾脏疾病方面发挥着重要作用，还具有抗氧化、抗炎以及近年来被发现的抗衰、护肤等功效。随着人们对健康和美容需求的不断增加，黄蜀葵在医药、保健品和美容等领域展现出巨大的应用潜力。

然而，目前对于黄蜀葵次生代谢产物合成的关键基因研究却十分匮乏。这主要是因为缺乏有效的基因表达检测系统，而实时荧光定量 PCR（qPCR）作为一种精准的基因表达分析技术，其结果的准确性高度依赖于合适的内参基因选择。但到目前为止，黄蜀葵中还没有可用的内参基因用于转录本的标准化，这严重阻碍了对其分子生物学机制的深入探究。

为了攻克这些难题，来自华南农业大学的研究人员展开了一项深入的研究。他们的目标是筛选出适用于黄蜀葵不同组织和发育阶段的最佳内参基因。研究人员从黄蜀葵转录组中筛选并克隆了 11 个候选内参基因（eIF、GTP、PP2A₁、EIF4α、PP2A₂、ACT2、PP2A₃、vps、PHD、YLS 和 TUA），并运用 geNorm、NormFinder、BestKeeper 和 RefFinder 这四种算法，对这些基因在不同组织和开花阶段的表达稳定性进行了全面评估。最后，通过检测 bHLH147 和 bHLH148 这两个关键转录因子基因的表达，进一步验证了所选内参基因的适用性和可行性。

研究结果表明，在众多候选基因中，eIF 和 PP2A₁的表达稳定性最高。在不同组织的稳定性分析中，这两个基因在多数算法评估下都名列前茅。例如，geNorm 分析显示，PP2A₁在多个组织样本中稳定性表现出色；RefFinder 综合分析也将 eIF 和 PP2A₁排在混合样本组的前列。同时，研究发现使用 eIF 或 PP2A₁单独作为内参基因，或者两者组合使用，能够有效提高 qPCR 基因表达分析的准确性。利用这些稳定的内参基因对 bHLH147 和 bHLH148 进行表达分析，发现这两个基因在黄蜀葵花不同发育阶段呈现出特定的表达模式，且与转录组分析结果一致。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，采集健康成熟的黄蜀葵种子，在华南农业大学实验田种植，收获不同组织和开花阶段的样本；接着，使用试剂盒提取样本总 RNA 并合成 cDNA；然后，设计特异性引物，通过 qPCR 技术扩增候选基因；最后，利用四种算法对候选基因的表达稳定性进行评估。

研究结论部分明确指出，eIF 和 PP2A₁是黄蜀葵中最适宜的内参基因，它们在不同组织和开花阶段都能稳定表达。这一发现对于黄蜀葵的研究具有重要意义，为后续深入开展黄蜀葵功能基因分析、解析次生代谢产物调控机制提供了关键基础。通过这些稳定的内参基因，研究人员能够更加准确地探究黄蜀葵中各种代谢途径的合成机制，如多糖、多酚和黄酮类化合物的合成过程。这不仅有助于推动黄蜀葵在医药、保健品和美容等领域的进一步开发利用，还能为解决黄蜀葵在不同生长条件下代谢产物含量差异大的问题提供分子层面的解释。此外，基于黄蜀葵作为观赏花卉开花时间短的特点，后续研究还可以围绕其分子机制展开，有望提高其观赏价值，进一步提升社会效益。总之，该研究成果为黄蜀葵的深入研究和应用开辟了新的道路，具有广阔的发展前景。