探秘革兰氏阴性菌脂质转运奥秘：OmpF3–MlaA–MlaC 脂质穿梭系统的质谱解析

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Following phospholipid transfer through the OmpF3–MlaA–MlaC lipid shuttle with native mass spectrometry

本文利用原生质谱研究革兰氏阴性菌中 Mla 系统的脂质转运过程。发现 OmpF3–MlaA 可增强脂质加载，捕获了三元脂质穿梭复合物，且 MlaC 上内源性 PG 富集。该研究对理解细菌膜完整性和抗生素抗性意义重大。

　　### 革兰氏阴性菌的细胞包膜结构与 Mla 系统
革兰氏阴性菌的细胞包膜结构独特且复杂，由外膜、内膜和中间的周质空间组成，外膜的外叶主要是脂多糖（LPS），内膜和外膜的内叶含有不同比例的磷脂，如磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）和心磷脂（CDL） 。外膜的不对称完整性对革兰氏阴性菌的生存至关重要，若磷脂在外叶富集，会使细菌对抗生素等有害物质更敏感。因此，细菌进化出了脂质不对称性维持系统（Mla） 。
Mla 系统由外膜、周质和内膜中的蛋白质组成。外膜成分 MlaA 是一种单体 α - 螺旋脂蛋白，与外膜孔蛋白 OmpC 和 OmpF 结合，能从外膜外叶提取磷脂。周质成分 MlaC 是磷脂转运体，对磷脂有高亲和力，可与 PE 和 PG 共纯化。内膜成分 ABC 转运体 MlaFEDB 驱动磷脂从 MlaC 转移到内膜。

研究脂质转运的目的与方法

此前对 Mla 系统中磷脂从 MlaA 到 MlaC 的转运过程了解甚少，本研究旨在利用原生质谱（MS）研究这一过程，确定 MlaC 的脂质偏好以及 MlaA 是否为 MlaC 预选脂质。

实验结果

1. MlaC 共纯化脂质的特征：在大肠杆菌中共同表达 MlaC 和 MlaA 后，用原生质谱分析纯化的 MlaC，发现大部分纯化的 MlaC 与磷脂结合，主要结合的磷脂是 PG 和 PE，含有多种酰基链，如 32:1、33:1 等。还观察到 cyclopropane 脂质的富集，其在蛋白质过表达等压力条件下会增加。
2. MlaC 去脂后的脂质保留情况：用辛基 -β - 葡萄糖苷（OG）去除 MlaC 的内源性脂质，随着去脂时间增加，PE/PG 比例逐渐增加，表明 PE 脂质保留更强。去脂后，含有环丙烷脂肪酸且无饱和链的 34:2 和 35:2 脂质保留较多，而 34:1 脂质大量减少。
3. MlaC 中 PG 的富集现象：MlaC 共纯化的 PG 含量高于外膜中的 PG 含量。通过与大肠杆菌脂质提取物孵育实验以及对 MS¹光谱建模量化 PE/PG 比例，发现体外孵育时 MlaC 对 PE 和 PG 无偏好，但从大肠杆菌中提取的过表达 MlaC 的 PE/PG 比例接近 1:1，内源性表达的 MlaC 中 PG 也有较高富集。
4. MlaA 对脂质的招募作用：纯化的 MlaA 与 OmpF 形成复合物，通过与合成磷脂孵育实验发现，MlaA 能招募磷脂到 OmpF₃–MlaA 复合物，且对不同磷脂的结合亲和力受脂质头基、离子极性影响，MlaA 与所有研究的磷脂都结合，不预选择特定脂质。
5. MlaA 介导的 MlaC 脂质加载偏好：在体外实验中，OmpF₃–MlaA 显著增强了 DOPG 向 MlaC 的转移。通过对 MlaA 突变体的研究，证明了观察到的脂质加载增加主要是通过 MlaA 通道的脂质转移，而非非特异性脂质清除。MlaC 对 DOPG、DOPE 和 DOPS 的结合水平相似，对 PC 的结合效率较低，这可能与蛋白质 - 脂质相互作用的能量障碍以及溶液中脂质的可用性有关。
6. OmpF₃–MlaA–MlaC 复合物的组装与解离：将 OmpF₃–MlaA 和去脂的 MlaC 孵育，形成了三元 OmpF₃–MlaA–MlaC (apo) 复合物。加入 DOPG 后，该复合物部分解离，释放出脂质结合的 MlaC，表明脂质转移后蛋白质复合物会解离。

讨论

本研究发现内源性 MlaC 中 PG 富集，但在体外实验中未发现 MlaC 对 PG 的偏好或 MlaA 对 PG 的选择性，推测可能是由于 PG 在细菌外膜的翻转倾向、存在去除外膜外叶 PE 的其他机制，或者 MlaFEDB 在内膜对 PE 和 PG 的卸载效率不同。此外，重建了 OmpF₃–MlaA–MlaC 脂质穿梭系统，明确了其在革兰氏阴性菌外膜脂质转运中的关键作用，这对维持膜完整性和抗生素抗性至关重要。

材料和方法

1. 重组蛋白表达：按照报道的方案并稍作修改表达和纯化 MlaC 和 MlaA。将编码 MlaC 和 MlaA 的质粒共转化或单独转化到大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞中，在不同抗生素选择下培养，通过亲和层析纯化蛋白。
2. MlaC 的逐步去脂：对纯化的 His 标记的 MlaC 进行去脂，将其加载到 Ni - NTA 亲和柱上，用含 OG 的去脂缓冲液处理不同时间，然后透析和浓缩。
3. 内源性标记和纯化 MlaC：利用 λ Red 重组技术对内源性大肠杆菌 MlaC 进行 N 端 Twin - Strep 标记，通过 P1 噬菌体转导将融合等位基因导入野生型菌株 BW25113，经低渗裂解和亲和树脂纯化。
4. 质谱分析：使用 Q - Exactive UHMR 质谱仪进行原生质谱分析，Orbitrap Eclipse Tribrid 质谱仪进行结合脂质鉴定、原生自上而下质谱和脂质组学分析。
5. MlaC 的脂质加载：在含有洗涤剂的溶液中，将去脂的 MlaC 与合成脂质或大肠杆菌脂质提取物孵育，加入或不加入 OmpF₃–MlaA，孵育后通过缓冲液交换去除多余脂质，用质谱测量脂质结合的 MlaC 比例。
6. MD 模拟：使用 GROMACS 2022.5 进行 MD 模拟，基于 MlaC 的晶体结构生成输入结构，用 CHARMM - GUI 生成 GROMACS 输入文件，模拟蛋白质动力学和进行伞形采样。