PHLPP2：从失活伪磷酸酶到癌症与细胞调控新视角

【字体：大中小】 时间：2025年04月02日 来源：Proceedings of the National Academy of Sciences 9.4

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　　本文聚焦 Pleckstrin 同源域富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶（PHLPP）。研究发现，PHLPP2 是伪磷酸酶，在体外无催化活性，癌症基因组学也不支持 PHLPP1 和 PHLPP2 的抑癌作用。该研究为重新评估 PHLPP 功能提供依据，助力探索其在 Akt 信号通路及癌症中的非催化功能。

　　### PHLPP2 在 Akt 信号通路中的角色探究
细胞和机体的生长离不开生长因子，它们能激活细胞表面的受体酪氨酸激酶（RTKs）。RTK 激活后，会招募并激活小 GTP 酶（GTPase）Ras 和脂质激酶磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）。PI3K 可将质膜中的磷脂酰肌醇 - 4,5 - 二磷酸（PIP₂）转化为脂质第二信使磷脂酰肌醇 - 3,4,5 - 三磷酸（PIP₃）。PIP₃能招募并激活丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 Akt 及其上游激活剂磷脂酰肌醇依赖性激酶 1（PDK1）。Akt 和 PDK1 对细胞生长、增殖、分化和代谢等关键过程至关重要，比如维持葡萄糖稳态。脂质磷酸酶和肿瘤抑制因子 —— 磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN），可通过将 PIP₃转化回 PIP₂来减弱 PI3K 信号。在人类癌症中，经常能观察到 Ras、PI3K 的突变以及 PTEN 的缺失。Akt 自身在癌症以及罕见的过度生长疾病 —— 普洛透斯综合征（Proteus syndrome）中也存在突变。

Akt 属于 AGC 激酶家族，包含一个能结合 PIP₃的普列克底物蛋白同源（PH）结构域和一个激酶结构域，该激酶结构域带有两个调节磷酸化基序。PDK1 会使 Akt1 激活环中的 T308 位点磷酸化，而哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 2（mTORC2）通常被认为能使 Akt1 疏水基序中的 S473 位点磷酸化。Akt 的 C 末端尾巴上还有一个磷酸化位点 —— 转角基序，它会持续磷酸化并控制 Akt 的稳定性。T308 和 S473 位点的磷酸化会促使 Akt 相应基序从无序状态转变为有序状态，进而激活 Akt 。PTEN 对 PIP₃的周转会导致 Akt 解离并失活。Akt 失活过程中一个重要但未被完全理解的环节，是蛋白磷酸酶对 T308 和 S473 位点的去磷酸化作用。T308 位点可被蛋白磷酸酶 2A（PP2A）去磷酸化，而 S473 位点据报道是 PH 结构域富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶 PHLPP1 和 PHLPP2 的作用靶点。最初，人们假设由于 S473 位点的磷酸化对生长因子或血清敏感，那么相应的磷酸酶可能含有 PH 结构域，基于此鉴定出了 PHLPP。然而，目前尚不清楚这些磷酸酶靶向 Akt 进行去磷酸化的具体机制，以及它们特异性的结构基础。

PHLPP2 对 Akt 无检测到的活性

为探究 PHLPP2 在 Akt 信号通路中的作用，研究人员表达并纯化了 GST 标记的全长人 PHLPP2。通过一系列实验，如质谱法、分析型尺寸排阻色谱和热稳定性测定等，证实了纯化的 PHLPP2 纯度高、主要以单体形式存在且折叠正确。

此前研究表明 Akt 是 PHLPP1 和 PHLPP2 的底物。研究人员利用孔雀石绿测定法（MGA）检测重组 PHLPP2 对合成的 Akt 磷酸肽的活性。结果令人意外，PHLPP2^D1024N突变体与野生型 PHLPP2 对 Akt1 激活环肽的活性相当。野生型 PHLPP2 对激活环肽和疏水基序肽虽有极低且不稳定的活性，但用 12.5 nM 冈田酸处理后，活性完全消失。冈田酸是一种由多种甲藻产生的高特异性 PP2A/PP4/PP6 抑制剂和毒素。由于 PP2A 参与 Akt1 的去磷酸化过程，研究人员怀疑纯化的 PHLPP2 被 PP2A 污染。经检测，在纯化的 PHLPP2 中确实发现了 PP2A 的三个亚基。PP2A 全酶的存在解释了观察到的磷酸酶活性对冈田酸敏感的现象。

为进一步验证，研究人员从 HEK293 细胞中免疫沉淀异位表达的 V5 标记的 PHLPP2，并进行连续洗涤和磷酸酶活性检测。结果发现，可测量的磷酸酶活性可被逐步洗掉，且残留活性能被冈田酸抑制。这表明之前报道的 PHLPP 活性可能源于污染的磷酸酶。此外，研究人员构建了 PHLPP2 基因敲除的 HEK293 细胞，并进行转录组分析。结果显示，敲除 PHLPP2 导致 641 个基因显著失调，但这些基因主要富集在 RNA 调节和转录相关功能，与 Akt 活性无直接关联，也未发现对 FOXO1 靶基因的显著调控，这进一步说明 PHLPP2 可能并不参与 Akt 信号通路的调控。

PHLPP2 是伪磷酸酶

为确定纯化的 PHLPP2 中检测到的活性是否来自污染的 PP2A，研究人员改进了纯化方案，使用微囊藻毒素 - LR（Microcystin-LR）共价偶联的琼脂糖珠（PIBs）去除 PP2A。微囊藻毒素 - LR 是一种高亲和力的不可逆 PP1、PP2A、PP3、PP4 和 PP6 磷酸酶抑制剂，能与 PP2A 的 C269 位点形成共价键，并与冈田酸结合在 PP2A 的同一结合位点。实验证实，PIBs 能有效富集 PP2A，且不会富集重组 PHLPP2。

经 PIB 处理的 PHLPP2 对 Akt 磷酸肽完全失去可检测的活性，即便其浓度比已知生理浓度高 500 倍。此外，纯化后的 PHLPP2 对通用磷酸酶底物对硝基苯磷酸酯（pNPP）也无活性，而 λ 磷酸酶在相同条件下能有效使 pNPP 去磷酸化。这表明纯化后的、不含 PP2A 的 PHLPP2 确实没有磷酸酶活性。

那么，在细胞中是哪种磷酸酶使 Akt 去磷酸化并失活呢？研究人员在 HAP1 细胞中敲除 PP2A 的调节亚基 B56α、B56β、B56γ 以及 B56α/β 双敲除，并与野生型 HAP1 细胞对比 Akt1 T308 和 S473 位点的磷酸化状态。结果发现，敲除 B56α 亚基会使 Akt1 在 T308 和 S473 位点的磷酸化显著增加，用冈田酸抑制所有 PP2A、PP4 和 PP6 酶会导致 Akt1 磷酸化急剧增加。这表明 PP2A B56α 磷酸酶是细胞中负责 Akt 去磷酸化的主要酶。

PHLPP2 是结合锌离子的蛋白且金属离子计量比改变

金属依赖性蛋白磷酸酶（PPM）家族成员，如蛋白磷酸酶 Mg²⁺/Mn²⁺依赖性（PPM1A），其催化需要活性位点中的两个或三个二价金属离子。然而，PHLPP1 和 PHLPP2 在一些关键的金属离子配位残基上保守性较差。

研究人员通过尺寸排阻色谱 - 电感耦合等离子体质谱（SEC-ICP-MS）分析，发现纯化的 PHLPP2 中仅含有一个锌离子，未检测到铁、铜、锰或钙的信号。利用 AlphaFold2 预测的磷酸酶结构域，确定了最可能的锌配位残基为 C799、D820、D822 和 D1024，它们对应于 M2 金属离子结合位点。通过实验，用碘乙酰胺（IAA）在天然条件下烷基化纯化的 PHLPP2，再用甲基甲硫基磺酸（MMTS）在变性条件下烷基化，经串联质谱分析，发现 C799 在天然条件下受保护不被烷基化，从而证实其参与锌离子的配位。

研究人员还通过分子动力学（MD）模拟和 ONIOM 方法对锌离子结合位点进行建模。结果显示，锌离子结合位点呈近似四面体几何结构，且结合位点在能量上对锌离子优化。由于所有已知的 PPM 家族磷酸酶催化至少需要两个金属离子（M1 和 M2），PHLPP2 仅含一个锌离子，这就解释了其缺乏催化活性的原因。

癌症基因组学不支持 PHLPP1 或 PHLPP2 作为肿瘤抑制因子的作用

由于 PHLPP2 没有可检测的磷酸酶活性，研究人员对 PHLPP1 和 PHLPP2 作为肿瘤抑制因子的证据进行探究。Akt1、Akt2 和 Akt3 都是公认的致癌基因，存在功能获得性（GOF）突变热点。

研究人员分析了癌症体细胞突变目录（COSMIC）数据库中 PHLPP1 和 PHLPP2 的同义（沉默）和非同义（错义）突变，并与癌症基因普查（CGC）中的肿瘤抑制基因、致癌基因以及嗅觉受体基因进行对比。结果发现，PHLPP1 和 PHLPP2 的突变率与嗅觉受体基因相似，与肿瘤抑制基因 PTEN、TP53 以及致癌基因 KRAS、BRAF 的突变率差异显著。在拷贝数变异（CNVs）方面，PTEN 和 TP53 表现出高频率的拷贝数丢失（CNL），符合其肿瘤抑制功能；KRAS 和 BRAF 则表现出高频率的拷贝数增加（CNG），与其致癌潜力相符；而 PHLPP1 和 PHLPP2 的 CNVs 频率与嗅觉受体基因相近。

此外，研究人员分析了多个癌症细胞系的基因编辑筛选数据，包括依赖图谱（DepMap）公共 23Q4+Score（Chronos）CRISPR 基因敲除筛选、Achilles+DRIVE+Marcotte（DEMETER2）RNA 干扰（RNAi）敲低筛选以及拷贝数效应校正的 CRISPR 基因敲除筛选，均未发现 PHLPP1 或 PHLPP2 是癌细胞的必需基因。同时，在全基因组关联研究（GWAS）中，也未发现 PHLPP1 或 PHLPP2 与癌症存在关联，合成致死筛选也未发现涉及它们的合成致死相互作用。这些结果表明，目前缺乏证据支持 PHLPP1 或 PHLPP2 的失调与癌症相关。

PHLPP2 的调节结构域排列保守

PHLPP1 和 PHLPP2 都包含一个 N 端 Ras 相关（RA）结构域、一个 PH 结构域、一个富含亮氨酸重复（LRR）结构域和一个 C 端蛋白磷酸酶 2C（PP2C）结构域。通过旋转阴影电子显微镜观察，发现重组 PHLPP2 呈规则的马蹄形构象，与 AlphaFold2 预测的结构相符。

利用单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）对 PHLPP2 进行结构解析，得到两种不同的重构结果，这两种构象的差异主要体现在 PH 结构域的位置上，其表现出较高的灵活性，是结构中分辨率最低的部分。LRR 结构域存在弯曲，PP2C 和 RA 结构域有压缩现象，这些变化可能会影响磷酸酶结构域的可及性。总体而言，AlphaFold2 预测的 PHLPP2 结构能较好地拟合两种构象的粒子体积。

PHLPP 基因的进化与多样化

为探究 PHLPP 的功能，研究人员通过系统发育学重建其进化历史。发现 PHLPP 家族在真核生物进化早期就已出现，可能源于 LRR 蛋白与 PP2C 家族磷酸酶的融合。其祖先基因编码催化活性所需的所有残基，包括 M1 和 M2 金属离子的配位残基。研究人员表达并纯化了来自变形虫纲 Stenamoeba stenapodia 的重组 PHLPP 相关 LRR-PP2C 磷酸酶（SsLRR-PP2C），证实其具有浓度依赖性的磷酸酶活性，且该活性对冈田酸不敏感，能被二价金属离子螯合完全消除。

在约 10 亿年前，在 opisthokonts（如动物和真菌）的最后共同祖先中，祖先 LRR-PP2C 基因获得了一个 RA 结构域并随后发生复制。之后，一个拷贝获得了 PH 和激酶结构域，形成了 PHLPP 家族；另一个拷贝获得了 III 类腺苷酸环化酶（AC），产生了 Cyr1 家族。PHLPP 和 Cyr1 在单细胞 holozoans 中均有保留，但在动物中 Cyr1 丢失，在真菌中 PHLPP 丢失。

在真菌中，Cyr1 获得了 Ras 依赖的功能，酿酒酵母 Cyr1 的 AC 活性可被 GTP 结合的 RAS1 或 RAS2 激活。AlphaFold2 预测 RAS1/2 与 Cyr1 的相互作用模型与实验确定的 KRAS 与其他蛋白 RA 结构域的相互作用结构相似。在大肠杆菌中重构酵母 Cyr1 的 AC 活性，表明 Cyr1 和 RAS 对 cAMP 的产生是必要且充分的。RAS 的法尼基化对 Cyr1 的激活至关重要，这表明 RAS?GTP 依赖性地将 Cyr1 招募到质膜可能驱动 Cyr1 AC 结构域的二聚化。AlphaFold2 预测 Cyr1 的 C 末端结构域（CTD）可与环化酶相关蛋白（CAP）结合，形成异源四聚体。通过组合预测的相互作用模型，可得到 Cyr1 - RAS - CAP 异源六聚体（2:2:2）的高可信度预测。

在 PHLPP 家族中，获得 PH 结构域似乎与 C 末端通过激酶结构域的新功能化同时发生。有趣的是，系统发育学表明该激酶结构域属于 AGC 激酶家族，包括 AKT 和蛋白激酶 C。但在动物祖先中，该激酶结构域与磷酸酶活性位点同时丢失。其功能意义尚不清楚，但暗示了 PHLPP 与 AGC 激酶之间可能存在的祖先联系。

PHLPP 可能在膜上具有替代的支架作用

尽管 PHLPP 似乎发生了假基因化，但脊椎动物 PHLPP 的表面保守性分析表明，在 PH 结构域表面和 PP2C 结构域中约 50 个氨基酸的插入区域存在两个高度保守区域。虽然脊椎动物 PHLPP 保留了 RA 结构域，但失去了与 RAS 的结合能力，其 RA 结构域与 RAS 结合的表面区域在 PHLPP1 和 PHLPP2 中序列差异最大。

PH 结构域的获得可能替代了 RAS 结合，用于膜定位。静电表面电位分析显示，PHLPP2 的 PH 结构域表面与磷酸肌醇结合位点重叠，且 PHLPP2 在蛋白质 - 脂质覆盖实验中对单磷酸化的磷酸肌醇（PI），尤其是 PI (4) P 有强烈结合偏好，这表明 PHLPP2 可能在细胞膜上发挥作用。PP2C 结构域中 FLAP 亚结构域的表面保守性与底物结合相关，且与细菌中 PP2C 磷酸酶的 FLAP 结构域同源，暗示脊椎动物 PHLPP 虽失去磷酸酶活性，但可能保留了底物结合能力。

通过系统发育基因组分析，研究人员发现 PHLPP2 在至少四个动物谱系中丢失，同时鉴定出六个与 PHLPP2 共进化的基因，这些基因多与膜相关或分泌，提示 PHLPP2 可能在膜上存在替代的、不依赖 AKT 的功能相互作用。

研究讨论

PHLPP2 是伪磷酸酶：纯化的全长 PHLPP2 在体外对 Akt 的 T308 或 S473 位点以及通用底物 pNPP 均无检测到的活性，即便浓度远高于细胞内水平。PHLPP2 仅含一个锌离子，无法进行典型的双核催化磷酸酯水解。此前报道的 PHLPP 的药理活性小分子抑制剂应谨慎对待。基于此，PHLPP1 和 PHLPP2 可能均为伪磷酸酶，这引发了对其在细胞中功能的思考。
PHLPP1 和 PHLPP2 在癌症中的作用缺乏证据：以往认为 PHLPP 具有肿瘤抑制功能，主要基于其与 Akt 磷酸化的相关性，但体外无磷酸酶活性的发现对此提出质疑。癌症基因普查中，PHLPP1 和 PHLPP2 不符合肿瘤抑制基因的标准，其在癌症中的作用值得进一步从非催化功能角度深入研究。
PHLPP 从祖先磷酸酶进化而来：PHLPP 从祖先磷酸酶进化为结构同源但功能可能不同的蛋白，是蛋白支架新功能化和亚功能化的实例。其进化过程中失去 RAS 结合能力，获得 PH 结构域用于膜定位。PHLPP 可能通过高度保守的 FLAP 亚结构域与其他蛋白相互作用，在膜结合亚区发挥支架作用，但这需要在细胞环境中进一步研究。此外，PHLPP1 曾被发现与昼夜节律、MAPK 信号调节和记忆形成相关，结合其与 AGC 激酶的潜在祖先联系，暗示其可能通过非催化机制调节激酶或参与残留的非功能性激酶相互作用。

综上所述，PHLPP 是伪磷酸酶，目前没有证据支持其在癌症中的作用。未来研究需聚焦其组织表达模式、亚细胞定位和相互作用组，从进化角度深入探索其参与的生物学途径。