肺异位生发中心 B 细胞亲和力成熟机制及其免疫意义：开启黏膜免疫新认知

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Lung B cells in ectopic germinal centers undergo affinity maturation

推荐阅读！本文聚焦肺异位生发中心（GCs），研究发现其虽结构与淋巴结 GCs 有差异，但能支持体细胞高频突变（SHM）和亲和力成熟，且可形成肺局部记忆 B 细胞（MBCs），为理解组织免疫及研发黏膜疫苗提供关键依据，值得一读。

　　

肺异位生发中心 B 细胞研究的重要意义

在生命科学和健康医学领域，肺部免疫一直是备受关注的研究方向。成熟的三级淋巴样结构（TLSs）在非淋巴组织中可维持类似生发中心的结构。本研究聚焦于肺部，揭示了过敏原诱导的肺异位生发中心（GCs）的重要特性，尽管其比淋巴结中的 GCs 更小且反应更慢，但却能进行体细胞高频突变（SHM）和亲和力成熟，生成的高亲和力 B 细胞还直接充实了肺部局部记忆 B 细胞（MBCs）库。这一发现对理解肺部免疫机制、开发新一代黏膜疫苗以增强组织驻留免疫具有关键意义。

研究背景与目的

TLSs 是在非淋巴组织中形成的淋巴细胞聚集体，其组成多样，从仅含 T 细胞的聚集物到包含功能性异位 GCs 的有序结构。TLSs 在多种生理和病理过程中发挥作用，在肿瘤附近，它与多种癌症的良好预后及对免疫检查点抑制剂治疗的更好反应相关；而在自身免疫性疾病如类风湿关节炎和桥本甲状腺炎中，它又会促进疾病进展，原因是其支持局部抗体反应。

与传统二级淋巴组织相比，TLSs 的功能仍有待深入探索。二级淋巴组织拥有专门的基质细胞网络，能在发育过程中支持和引导淋巴细胞反应及 GCs 形成。然而，TLSs 的形成需要先进行组织重塑，构建类似二级淋巴组织的成纤维细胞网络，例如诱导 B 细胞趋化因子 CXCL13 的表达在 TLSs 形成中起作用，但并非绝对必需。这种从头开始的组织重塑，使得 TLSs 及其内部的 GCs 在结构上与二级淋巴组织中的有所不同，可能是由于缺乏预先形成的基质细胞网络。鉴于 GCs 结构与二级淋巴组织中高亲和力抗体反应的产生相关，研究人员推测异位 GCs 在支持基于亲和力的选择方面能力较弱，而这种选择能产生高亲和力抗体分泌浆细胞和 MBCs。

本研究旨在表征鼻内过敏原激发后肺组织中异位 GCs 的形成过程，并评估其产生高亲和力体液免疫的能力。

研究方法

1. 动物实验：选用 C57BL/6^Babr小鼠和 B1-8ⁱ小鼠，在特定的饲养环境中进行实验。小鼠饲养遵循相关法规和标准，实验经动物福利和伦理审查机构批准。通过鼻内给予含有 100μg NP - KLH（钥孔戚血蓝蛋白）和 10μg HDM（屋尘螨）的 50μL PBS 进行免疫，在不同时间点采集肺和引流淋巴结进行分析。在淋巴细胞外渗抑制实验中，给小鼠腹腔注射 FTY720（一种阻止淋巴细胞从二级淋巴器官外渗的药物）或对照溶液。
2. 实验技术：运用多种实验技术，包括共聚焦显微镜观察肺组织中细胞分布；流式细胞术对淋巴细胞进行染色和分析；对处理后的 10X 测序数据进行重新分析以评估选择强度；利用自动化 MACSima 超高含量平台对组织进行处理和循环成像，分析 GCs 的结构和细胞组成；进行 Hematoxylin and Eosin（H&E）染色和明场成像观察组织微结构；采用 Nested W33L PCR 技术检测特定基因突变；对 IgG1⁺ NP⁺ B 细胞、GC B 细胞和 MBCs 进行荧光激活细胞分选；进行单细胞 BCR（B 细胞受体）和 RNA 测序及后续的质量控制和分析。在统计分析方面，鉴于样本量较小（n < 10），数据假定遵循非高斯分布，使用非参数统计检验，通过 GraphPad Prism 软件进行分析，以 P < 0.05 为具有统计学意义。

研究结果

1. 鼻内免疫诱导肺和纵隔淋巴结 GCs 反应：将 B1-8ⁱ B 细胞转移到 C57BL/6 小鼠后，进行鼻内 NP - KLH/HDM 免疫，结果显示在首次给药 8 天后，肺和肺引流纵隔淋巴结（medLN）中均诱导出 NP 特异性 GC B 细胞。虽然在第 10 天肺 GCs 中 B 细胞的扩增比例低于淋巴结 GCs，但 GC B 细胞和 NP 特异性细胞的频率变化在不同组织中呈现相似的动力学。免疫荧光共聚焦显微镜观察发现，在 NP - KLH/HDM 处理的动物肺组织中，有异位 B 细胞簇被 T 细胞包围，位于主要血管和气道附近。
2. 异位肺 GCs 与传统淋巴结 GCs 的结构差异：通过自动循环漂白荧光显微镜结合 H&E 染色分析，发现异位肺 GCs 平均比 LN GCs 小 5.7 倍，且 LN GCs 单位面积内的 GC B 细胞和 FDCs（滤泡树突状细胞）更多，结构更紧密。尽管如此，肺 GCs 中 Tfh 细胞（辅助性滤泡 T 细胞）、FDCs 和 Ki67⁺ B 细胞仍呈现出极性分布，与 LN GCs 类似。
3. 肺和纵隔淋巴结 GCs 的亲和力成熟情况：利用 NP - KLH 系统评估高亲和力 B 细胞的产生，对 NP 特异性 GC B 细胞的 V_H186.2 Cγ1 区域进行测序。结果表明，在免疫后第 14 天，肺 GC B 细胞中获得亮氨酸（W33L 突变，该突变可使亲和力提高 10 倍）的比例低于 medLN，但到第 21 天，两者比例相似，且此时两者的总突变数和 R/S（替换与沉默）突变比也相近，这说明肺异位 GCs 能够进行亲和力成熟，只是相较于淋巴结有所延迟。在对肺和 medLN 中 IgG1⁺ NP 特异性 MBCs 的分析中发现，两者获得 W33L 突变的频率相似，总突变数和 R/S 突变比也无显著差异。此外，对流感 A 病毒感染后的数据分析显示，虽然在感染后第 14 天肺 GC B 细胞的阳性选择强度低于 medLN，但到第 28 天，肺 GCs 的选择强度显著高于 medLN，进一步证明了肺异位 GCs 在病毒感染时也能进行亲和力成熟，只是动力学较慢。
4. 肺和淋巴结 GCs 的克隆关系：对 NP - KLH/HDM 免疫 21 天后小鼠的 GC 和 MBCs 进行单细胞 BCR 和转录组学分析，发现肺和淋巴结样本中均存在四个细胞簇，其中 Cluster 3 具有 MBC 特征，Clusters 0 - 2 富含 GC B 细胞基因。BCR 测序显示，肺和 LN 中均有克隆扩增，且大部分克隆是组织特异性的，仅有约 2% 的 LN 衍生克隆在肺异位 GCs 中被检测到。
5. 肺局部生成 MBCs 的能力：在 NP - KLH/HDM 免疫 21 天后，肺和 LN GCs 均对肺 MBC 池有贡献，但肺 GC B 细胞克隆在肺 MBC 池中的占比（9 - 10%）高于 LN GC B 细胞克隆（1 - 2%）。通过给予 FTY720 阻断淋巴细胞从淋巴结流出的实验表明，在阻断后，肺中 IgG1⁺ MBCs 和 IgG1⁺ NP 特异性非 GC B 细胞的数量在 FTY720 处理组和对照组中相当，这说明肺局部 GCs 能够在鼻内免疫后产生 MBCs，形成局部多样化的驻留 MBC 群体。

研究结论与展望

本研究表明，尽管异位肺 GCs 在结构上与传统淋巴结 GCs 存在差异，如更小且细胞密度更低，但它们具备完整的体细胞高频突变和选择过程，能够产生高亲和力 B 细胞，并为肺局部 MBCs 池做出贡献。这一发现意味着 TLSs 可以在局部生成多样化的 B 细胞库，提供组织特异性免疫。

肺 GCs 在感染时能够进行 SHM，且产生的高亲和力 B 细胞可直接充实驻留 MBC 池，这对于限制再感染具有重要意义。由于肺异位 GCs 中的 B 细胞可能对多种流感毒株具有交叉反应性，通过气溶胶疫苗刺激肺 GC 反应以产生 MBCs，有望为预防呼吸道感染提供新途径。

从进化角度来看，虽然二级淋巴组织可能进化出快速形成更大 GCs 的能力以应对感染，但异位 GCs 同样能够发挥类似功能，尽管其动力学较慢且 GCs 较小。在人类中，尤其是婴幼儿和儿童，由于 B 细胞多样性较低和 SHM 能力较弱，体液免疫较差，此时 TLSs 中的 GCs 可为呼吸道病毒感染提供体液保护。因此，针对肺部的疫苗可能具有独特优势，未来有望在这一方向进行更深入的研究和开发。