Pitx3 缺失致多巴胺能神经元凋亡机制揭秘：为帕金森病治疗点亮新希望

《Cell Death & Disease》：The absence of Pitx3 results in postnatal loss of dopamine neurons and is associated with an increase in the pro-apoptotic Bcl2 factor Noxa and cleaved caspase 3

帕金森病（PD）中黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元（mdDA）会丢失，为探究其机制，研究人员以 Pitx3 基因敲除小鼠为模型开展研究。结果发现 Pitx3 缺失导致 mdDA 神经元出生后凋亡，与促凋亡因子 Noxa 和裂解的半胱天冬酶 3（CC3）增加有关。该研究为 PD 等疾病提供新见解。

　　在神秘的大脑世界里，中脑多巴胺能神经元（mdDA）如同精密仪器上的关键齿轮，对调节运动和动机起着至关重要的作用。它们构成了黑质致密部（SNc）和腹侧被盖区（VTA），在大脑的正常运转中扮演着不可或缺的角色。然而，当帕金森病（PD）这个 “恶魔” 来袭，SNc 中的 mdDA 神经元会逐渐丢失，导致患者出现运动障碍等一系列症状，严重影响生活质量。

一直以来，科学家们都在努力探寻 mdDA 神经元发育、成熟、存活和消亡的奥秘，期望能找到治疗帕金森病的有效方法。其中，Pitx3 基因作为 mdDA 神经元发育过程中的关键转录因子，引起了众多研究人员的关注。此前研究发现，Pitx3 基因缺失会导致成年小鼠 SNc 消失，但对于 SNc 神经元究竟何时开始丢失，以及背后的机制是什么，科学界尚无定论。为了解开这些谜团，来自荷兰阿姆斯特丹大学斯瓦默丹生命科学研究所分子神经科学实验室（Swammerdam Institute for Life Sciences, Molecular Neuroscience Lab, University of Amsterdam）的 Willemieke M. Kouwenhoven、Edward J. Robinson 等研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Death and Disease》杂志上，为我们理解 mdDA 神经元的死亡机制和帕金森病的发病原因提供了新的线索。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，通过构建 Pitx3^GFP/+和 Pitx3^GFP/GFP小鼠模型，获取不同发育阶段（E12.5、E14.5、E16.5、E18.5、P2、P3）的小鼠胚胎或组织样本。其次，运用荧光激活细胞分选（FACS）技术分离特定细胞，再结合实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测相关基因的表达水平。此外，还利用荧光免疫组织化学技术对组织切片进行染色，以观察细胞形态和标记物表达情况；在细胞实验中，采用细胞转染和碘化丙啶（PI）染色等方法研究细胞凋亡情况 。

研究结果

1. Pitx3 缺失小鼠在 P3 时 GFP 阳性 mdDA 神经元显著减少：研究人员对不同发育阶段的 Pitx3^GFP/+和 Pitx3^GFP/GFP小鼠脑切片进行染色，通过 ImageJ 半自动化定量分析发现，在 E14.5、E16.5 和 E18.5 时，Pitx3^GFP/GFP小鼠与 Pitx3^GFP/+小鼠相比，GFP 阳性多巴胺能神经元数量并无明显差异。但在 P3 时，Pitx3^GFP/GFP小鼠 mdDA 区域的 GFP 阳性神经元数量显著少于 Pitx3^GFP/+小鼠。进一步分析发现，这些神经元的丢失主要集中在中脑外侧区域。同时，研究人员检测了作为细胞凋亡标记物的裂解半胱天冬酶 3（CC3），结果显示，P3 时 Pitx3^GFP/GFP小鼠中 GFP/CC3 双阳性神经元的比例显著高于 Pitx3^GFP/+小鼠，表明此时 mdDA 神经元的丢失可能与细胞凋亡有关。
2. Pitx3 缺失导致 Noxa mRNA 水平升高：为了探究参与细胞凋亡的因素，研究人员重新分析了之前的单细胞 RNA 测序数据，并对 P2 时 Pitx3^GFP/+和 Pitx3^GFP/GFP小鼠的 GFP 阳性神经元进行 FACS 分选，提取 RNA 后进行 RT-qPCR 实验。结果发现，Pitx3^GFP/GFP小鼠中促凋亡的 BH3-only 因子 Noxa 的相对表达水平比 Pitx3^GFP/+小鼠高约 4 倍。这表明 Noxa 可能在 Pitx3 缺失导致的 mdDA 神经元凋亡过程中发挥重要作用。
3. Noxa 过表达诱导多巴胺能 MN9D 细胞凋亡：为了验证 Noxa 过表达是否足以诱导细胞凋亡，研究人员将不同浓度的 Noxa 与少量空载体（EV）-mCherry 共转染到依赖 Mcl1 存活且不表达内源性 Noxa 的多巴胺能 MN9D 细胞中。结果显示，随着 Noxa 浓度的增加，凋亡标记物 CC3 的水平显著上升，而 mCherry 水平明显下降，表明 Noxa 在多巴胺能细胞中具有促凋亡作用。通过邻近连接实验（PLA）发现，Noxa 和抗凋亡蛋白 Mcl1 之间存在明显的相互作用，且 Noxa 过表达并未改变 Mcl1 的蛋白水平。此外，用 Bax 抑制肽 V5（BIP V5）预处理 MN9D 细胞后，能够显著减少 Noxa 诱导的 PI 染色阳性细胞数量和 CC3 水平，表明 Noxa 可能通过线粒体依赖的凋亡途径诱导细胞凋亡，且 Bax 的激活在这一过程中起到重要作用。

研究结论与讨论

综合以上研究结果，研究人员得出结论：Pitx3 缺失不会导致胚胎期 mdDA 神经元死亡，但会在出生后（P3）引起大量神经元丢失，其机制与细胞凋亡有关。在胚胎发育过程中，Pitx3 缺失导致 mdDA 神经元迁移异常，出现神经元错位现象。出生后，Noxa 表达增加，它可能通过与 Mcl1 相互作用，抑制 Mcl1 的抗凋亡功能，激活 Bax，进而诱导 mdDA 神经元凋亡，最终导致成年小鼠 SNc 缺失。

这一研究成果具有重要意义。一方面，它明确了 Pitx3 缺失导致 mdDA 神经元丢失的时间点和关键机制，为深入理解中脑多巴胺能神经元的发育和死亡调控提供了新的视角。另一方面，由于帕金森病的主要特征是 SNc 中 mdDA 神经元的进行性退化，该研究揭示的机制可能与帕金森病等神经退行性疾病的发病过程相关，为开发针对这些疾病的新治疗策略提供了潜在的靶点和理论依据。不过，目前研究主要基于小鼠模型，未来还需要进一步研究 Noxa 在人类大脑中的作用，以及相关机制在神经退行性疾病中的具体影响，从而推动帕金森病等疾病的临床治疗进展。