染色体级基因组组装助力解析软枣猕猴桃（Actinidia arguta）花青素调控机制：为果实色泽育种点亮新希望

《Molecular Horticulture》：Chromosome-level genome assembly assisting for dissecting mechanism of anthocyanin regulation in kiwifruit (Actinidia arguta)

为解决软枣猕猴桃花青素调控机制不明的问题，研究人员开展了软枣猕猴桃基因组组装及花青素调控机制的研究。通过多种分析，他们发现 AaBEE1 负调控花青素生物合成，明确了 AaBEE1 - AaLDOX 模块调控机制，这为软枣猕猴桃育种提供了重要参考。

　　软枣猕猴桃，作为猕猴桃家族的新兴成员，凭借其高颜值和丰富的花青素含量，一跃成为水果市场的 “宠儿”，深受消费者喜爱。然而，在这诱人的外表背后，隐藏着一个亟待解决的谜团 —— 软枣猕猴桃花青素的调控机制究竟是怎样的？目前，已有的猕猴桃基因组研究虽然为相关领域奠定了基础，但对于软枣猕猴桃，尤其是红色果肉品种的基因组解析仍存在空白，这严重限制了对其花青素相关基因的挖掘。因此，深入探究软枣猕猴桃花青素调控机制，不仅有助于揭示果实颜色形成的奥秘，更为培育色泽稳定、品质优良的软枣猕猴桃新品种提供关键理论支撑。

为解开这一谜团，中国农业科学院郑州果树研究所的研究人员勇挑重担，开展了一项极具意义的研究。他们以软枣猕猴桃红色品种‘Tianyuanhong’为研究对象，成功组装出近乎完整的染色体级基因组，并通过一系列深入研究，揭示了其花青素调控的关键机制。相关研究成果发表在《Molecular Horticulture》杂志上。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过 PacBio Revio 测序平台对‘Tianyuanhong’进行基因组测序，并结合 Hi - C 数据进行基因组组装；利用多种软件进行基因注释、重复序列分析等；开展 RNA - seq 分析筛选关键基因；运用酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、染色质免疫沉淀 - 定量 PCR（Chip - qPCR）和双荧光素酶（LUC）等实验验证基因间的相互作用；还通过稳定遗传转化和病毒诱导的基因沉默（VIGS）等技术对基因功能进行验证。

研究结果主要如下：

• 基因组组装与比较分析：研究人员成功组装出‘Tianyuanhong’的染色体级基因组，其 N50 达 21 Mb。与其他猕猴桃基因组相比，‘Tianyuanhong’基因组更大且基因更多，可能源于同源四倍体化过程中的基因扩张。通过构建系统发育树发现，软枣猕猴桃与茶树遗传关系较近，且基因家族的扩张和收缩与软枣猕猴桃的特异性状形成相关。
• 关键转录因子的筛选：研究人员对两个不同颜色的软枣猕猴桃品种‘ZHB’和‘ZLB’进行 RNA - seq 分析，筛选出 15 个共同下调的差异表达基因（DEGs）作为候选基因。其中，Aar28009（命名为 AaBEE1）被确定为关键候选转录因子（TF）。AaBEE1 的表达与果实着色呈负相关，过表达 AaBEE1 会抑制烟草和软枣猕猴桃果实中花青素的积累，表明其是花青素途径的负调控因子。
• AaBEE1 的功能验证：研究人员在多种植物中进行 AaBEE1 的稳定遗传转化和瞬时过表达实验。结果显示，过表达 AaBEE1 会抑制拟南芥、番茄和烟草中花青素的合成和积累，且结构基因，特别是 LDOX 的表达受到抑制，进一步证实 AaBEE1 通过影响结构基因的表达来抑制花青素的生物合成和积累。
• AaBEE1 靶基因的鉴定：通过 DNA 亲和纯化测序（DAP - seq）分析，研究人员发现 AaBEE1 的结合峰主要分布在转录起始位点（TSS）上游 2 kb 的启动子区域，且与黄酮类生物合成过程相关。其中，AaLDOX 被预测为 AaBEE1 的直接靶基因，后续通过 Y1H、EMSA、Chip - qPCR 和 LUC 等实验证实了 AaBEE1 能够结合到 AaLDOX 启动子的 G - box 元件上，抑制其活性，进而抑制 AaLDOX 的表达。
• AaLDOX 的功能验证：研究人员发现 AaLDOX 编码的无色花青素双加氧酶催化无色花青素向花青素的转化，是软枣猕猴桃花青素生物合成的关键结构基因。过表达 AaLDOX 会加速软枣猕猴桃果实中红色素的积累，而沉默 AaLDOX 则会抑制红色素积累，表明高表达的 AaLDOX 对软枣猕猴桃的红色着色至关重要。
• AaLDOX 启动子的变异分析：研究人员对 176 份软枣猕猴桃种质的 AaLDOX 启动子进行克隆和分析，发现一个 29 - bp 的插入 / 缺失（indel）变异与果实红 / 绿性状高度相关。携带 29 - bp 插入的启动子活性更高，该 indel 变异可作为软枣猕猴桃花色育种的分子标记。

研究结论和讨论部分表明，本研究成功组装了软枣猕猴桃‘Tianyuanhong’的高质量染色体级基因组，揭示了基因家族的扩张和收缩在软枣猕猴桃物种特异性状形成中的作用。首次发现 AaBEE1 作为负调控因子，通过直接靶向 AaLDOX 启动子抑制其表达，进而调控花青素的生物合成。此外，研究还发现了与果实颜色相关的 29 - bp indel 变异，并开发了相应的分子标记，为软枣猕猴桃的育种提供了有力的工具。该研究不仅为深入理解软枣猕猴桃花青素调控机制提供了新的视角，也为其他果树的相关研究提供了重要参考，在果树遗传育种领域具有重要的理论和实践意义。