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这篇综述聚焦结直肠癌（CRC）中循环肿瘤 DNA（ctDNA）。ctDNA 作为新兴生物标志物，在肿瘤监测、治疗决策等方面潜力巨大。文章详细阐述其生物学特性、检测方法，以及在多种临床场景中的应用，为 CRC 精准诊疗提供重要参考。
### 1. 引言
结直肠癌（CRC）在全球发病率位居第三，死亡率位列第二。目前，单一组织活检分析难以全面、实时反映肿瘤的基因表达特征，液体活检技术的出现为解决这一困境带来希望。循环肿瘤 DNA（ctDNA）作为液体活检的重要组成部分，与肿瘤细胞具有相同的遗传和表观遗传特征，在肿瘤的综合分子分析、分子残留疾病（MRD）检测、早期癌症诊断、治疗反应评估及治疗决策指导等方面展现出巨大潜力。本文将对 ctDNA 分析领域的最新进展进行综述。
2. cfDNA 的生物学特性
2.1 cfDNA 的来源
ctDNA 是 cfDNA 的重要组成部分，在总 cfDNA 中占比不到 1%。肿瘤细胞凋亡是 ctDNA 释放的主要机制，在肿瘤广泛坏死时，坏死则成为主要释放途径。此外，肿瘤微环境中的粒细胞、淋巴细胞、生殖细胞甚至微生物群也可释放 cfDNA。有研究表明，CRC 患者体内升高的 cfDNA 可能主要来源于白细胞，尤其是中性粒细胞。肿瘤外泌体的主动分泌也是 ctDNA 释放的重要机制，但目前对 ctDNA 在肿瘤来源的细胞外囊泡（EVs）中的空间分布了解有限。
2.2 影响 CRC 患者 ctDNA 水平的因素
CRC 患者血液中 cfDNA 浓度差异显著，范围在 22 - 3922 ng/ml，而健康个体仅为 5 - 16 ng/ml。循环中，游离的 cfDNA 分子稳定性低于与蛋白质、EVs 或核小体结合的分子。
- 脱氧核糖核酸酶（DNase）活性：胃肠道癌症患者的 DNase 活性低于正常人，导致 cfDNA 浓度升高。肿瘤负担、肿瘤细胞周转、肿瘤的血管化程度和空间位置等也会影响 DNase 活性，进而影响 cfDNA 浓度。
- 肿瘤分期、亚型和转移部位：不同研究中 ctDNA 的检测率有所差异，I - III 期 CRC 患者的检测率约为 40% - 90%，转移性 CRC（mCRC）患者接近 100%。病理亚型会影响 ctDNA 丰度，如具有黏液特征的 CRC 患者 ctDNA 水平低于腺癌患者。在 mCRC 患者中，转移部位不同，ctDNA 水平也不同，肝或淋巴结转移患者的 ctDNA 水平高于肺或腹膜转移患者。此外，早期局部复发患者的 ctDNA 水平可能较低。
- 其他变量：巨噬细胞吞噬和中性粒细胞胞外陷阱形成等细胞事件会影响 ctDNA 丰度。肿瘤细胞的甲基化水平也与 cfDNA 释放数量有关，低甲基化水平的肿瘤释放的 cfDNA 分子更多。另外，人口统计学特征、非癌症疾病、个体行为、身体状况、环境暴露和药物使用等因素也会对 ctDNA 丰度产生影响。
2.3 ctDNA 的短半衰期有助于动态评估治疗反应
ctDNA 在循环中会被巨噬细胞降解，降解产物经尿液排出或被肝脾吸收，其半衰期为 16 分钟至 2.5 小时。这使得 ctDNA 能够作为治疗反应的实时标志物，弥补传统影像学评估的不足。
3. 下游分析前的预分析变量考量
典型的 cfDNA 分析流程包括血液采集、血浆 - 血细胞分离、cfDNA 提取和下游分析。多个预分析变量会影响 ctDNA 的产量。
3.1 基质和采血管（BCT）
血浆是提取 cfDNA 的最佳基质，相比血清，它可减少白细胞裂解导致的样本污染，避免 ctDNA 黏附于血凝块，还能保留血小板这一肿瘤来源核酸的重要来源。血液采集量通常为 15 - 20 ml，但检测 MRD 时可能需要更大体积，而在肿瘤负担较高的情况下，较小体积血液可能就足够检测。BCT 的选择主要取决于血液采集到样本处理的时间以及下游分析类型。EDTA BCT 因具有体外抑制 DNase 和抗凝作用，且与基于 PCR 的 ctDNA 下游分析兼容，是最常用的采血管。若血液样本处理延迟超过 6 小时，建议使用细胞稳定型 BCT，它能抗凝并稳定白细胞，防止样本中 ctDNA 污染，还可在不同温度（4°C 或室温）下长期保存（超过 7 天）。
3.2 血浆储存和离心
为保持 ctDNA 分子完整性，应避免多次冻融循环、运输过程中样本晃动以及采血管中出现气泡，且在整个分析过程中建议对样本进行分装。血液采集后短期储存（通常小于 7 天），4°C 至室温的温度波动不会影响 ctDNA 完整性；长期储存则建议将血浆样本保存在 - 80°C。研究表明，无论使用 EDTA BCT 还是细胞稳定型 BCT，双离心方案都能提高 cfDNA 浓度，推荐使用该方案来增加血浆提取过程中 ctDNA 的产量。通常，第一轮离心速度约为 800 - 1600 g，防止淋巴细胞裂解产生的白细胞来源 DNA 降低信噪比；第二轮离心速度约为 14,000 - 16,000 g，以去除细胞碎片和其他污染物。
3.3 cfDNA 提取
硅胶膜柱和磁珠技术在手动或自动提取方案下，提取的 cfDNA 数量、质量和可用性相似。市面上有多种用于下游分析的商业 cfDNA 提取试剂盒，可提高 ctDNA 产量或短片段 DNA 回收率，在临床常规实践中使用更方便、可靠。
4. 基于 PCR 和 NGS 的技术：ctDNA 下游分析的常用方法
ctDNA 的下游分析需要高灵敏度的检测方法，基于 PCR 和下一代测序（NGS）的方法应用广泛。PCR 方法的检测限（LoD）为 0.01% - 0.1%，NGS 方法的 LoD 因具体方法而异，部分可达 0.01%。不同研究中常见检测的分子异常包括单核苷酸变异（SNVs）、插入 / 缺失（indels）、拷贝数变异（CNVs）和染色体重排（CRs）。
4.1 基于 PCR 的方法
定量 PCR（qPCR）可快速、经济、简便地对体细胞突变进行相对定量，LoD≤10%。先进的 qPCR 技术如 COLD - PCR，检测 CRC 中 KRAS 突变的 LoD 可达 0.1%。数字滴液 PCR（ddPCR）能更灵敏、快速、简便且经济地对 ctDNA 中极罕见的肿瘤体细胞突变进行绝对定量，LoD 为 0.1%。BEAMing（Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics）结合了 ddPCR、磁珠和流式细胞术，检测 ctDNA 中极低频率突变的性能优异，LoD 可达 0.01%，但为确保最佳检测效率和减少采样偏差，分析时 DNA 输入量通常需超过 60ng，且其特异性和灵敏度与分析中使用的探针设计和特性密切相关。
4.2 基于 NGS 的方法
基于 NGS 的方法一次运行可对数百万个 DNA 片段和感兴趣基因进行测序。但与组织样本测序不同，在血浆中检测低频突变需要更深的测序深度，并使用分子条形码等技术减少测序误差。可分为靶向检测方法和非靶向检测方法。
- 靶向方法：癌症个性化深度测序（CAPP - Seq）利用杂交捕获、高选择性探针和增强的生物信息学算法提高分析灵敏度。安全测序系统（Safe - Seq）结合独特分子条形码和冗余测序，可在约 5×103 - 1×10?个野生型分子中检测到单个突变分子，能高灵敏度检测极低频率突变。Guardant360 采用杂交捕获和数字测序增强灵敏度，结合生物信息学和分子条形码减少测序误差，LoD 为 0.1%，在多项前瞻性研究中准确性高。FoundationOne 使用先进生物信息学算法提高准确性，可检测碱基替换、indels、CNVs、染色体重排、微卫星不稳定性（MSI）和血液来源的肿瘤突变负荷（bTMB）等改变。
- 非靶向方法：全基因组测序（WGS）和全外显子组测序（WES）可在无需预先了解肿瘤分子异常的情况下检测致病突变。WGS 比 WES 基因组覆盖更全面，虽成本高、灵敏度相对较低，但在检测 CNVs 和 CRs 方面比靶向测序方法更具优势，已应用于 MRD 检测，在识别具有独特驱动突变的肿瘤以及为定制小面板深度测序 MRD 策略选择候选基因方面发挥关键作用。
5. 基于多分析物和表观遗传学的 ctDNA 分析平台可检测早期癌症
研究表明，CRC 相关的甲基化 ctDNA 标记物在临床诊断前 2 年即可检测到，支持 ctDNA 检测可识别早期癌症的假设。在≥70% 的局限性 CRC 病例中可检测到 ctDNA，且大多数反映肿瘤发生和进展的致病改变也可在 ctDNA 中鉴定出来，凸显了 ctDNA 分析在癌症筛查中的潜在价值。Guardant Shield 检测已获 FDA 批准，用于 45 岁及以上平均风险成年人的 CRC 血液筛查，对 I - III 期 CRC 的检测灵敏度为 83.1%，对晚期癌前病变的识别灵敏度为 13.2%。基于甲基化和多分析物的 ctDNA 分析平台在早期癌症筛查中各有优势，但目前仍存在一些问题，如检测癌前病变的灵敏度较低、癌前结直肠病变异质性大且 DNA 释放少、假阳性会增加后续检查成本等，需要整合更多技术来提高检测的灵敏度、特异性和 LoD。
6. ctDNA 在 CRC 术后的作用
6.1 MRD 检测策略
通过 ctDNA 分析检测 MRD 可分为肿瘤知情和肿瘤未知两种方法。
- 肿瘤知情方法：常见的肿瘤知情分析流程是对活检或手术标本进行 WES 或大面板 NGS，获取肿瘤基因组特征，结合原发性肿瘤驱动基因建立肿瘤特异性面板，再通过超深度 PCR 或 NGS 进行高灵敏度的 MRD 检测。例如，Reinert 等人利用 Signatera 研究 II 期 CRC 患者 ctDNA 阳性与复发的关系，对肿瘤组织进行 1042 个 SNV 位点的 NGS 检测后，为每位患者设计包含 16 个高排名肿瘤特异性 SNVs 和短 indels 的面板，使用 HiSeq 2500 系统进行 NGS 测序，测序深度 > 105,000X / 扩增子，LoD 为 0.001% VAF，将 ctDNA 阳性定义为在一个血浆样本中至少检测到两个变异。但该方法存在局限性，如单次活检无法完全捕获肿瘤基因组全貌、肿瘤基因组特征可能随时间变化、肿瘤变异选择和测序深度主观、ctDNA 阳性判定标准不统一且活检具有侵入性和高成本等。
- 肿瘤未知方法：该方法无需了解肿瘤基因组景观，使用固定基因面板检测目标区域突变，但测序深度受限，灵敏度较低且假阳性率较高。不过，可通过使用更大基因面板和优化生物信息学算法、整合多种测序技术或使用更灵敏的 PCR 技术等策略优化其准确性。例如，Chen 等人建立了 425 基因面板（Geneseeq Prime）用于量化 ctDNA 中的突变丰度，测序深度为 4693X，将 ctDNA 阳性定义为真实变异数超过所有跟踪变异数的 5%；Guardant Reveal 整合 ctDNA 突变和 ctDNA 甲基化水平检测，LoD 低至 0.01%，在一项前瞻性研究中，其 MRD 检测灵敏度为 91%，特异性为 100%。肿瘤未知方法具有缩短周转时间、降低成本和能够大规模检测可疑突变等优势。在临床研究中，选择肿瘤知情还是肿瘤未知策略主要取决于肿瘤组织的可用性、成本效益以及具体 MRD 检测方法的可靠性。
6.2 MRD 在指导辅助治疗、监测反应和预后评估中的作用
CRC 术后辅助化疗（ACT）的必要性存在争议，需要更好的预测生物标志物来帮助选择受益患者。DYNAMIC 研究首次利用 ctDNA 分析对 II 期结肠癌患者进行风险分层以确定 ACT 的必要性，结果显示 ctDNA 指导组 ACT 使用率较标准管理组降低近 50%，且不影响 2 年和 3 年无复发生存率（RFS），表明 ctDNA 指导方法的非劣效性。AGITG DYNAMIC - Rectal 研究评估了 ctDNA 在指导局部晚期直肠癌（LARC）患者 ACT 中的作用，结果显示 ctDNA 指导组接受 ACT 的患者显著少于标准管理组，且两组 3 年 RFS 率相当。新兴研究表明，ACT 治疗后 ctDNA 的变化可作为治疗效果和预后的标志物。GALAXY 研究将 ACT 术后第 4 周和第 12 周 ctDNA 变化分为持续阴性、由阳转阴、由阴转阳和持续阳性四种模式，四种模式的 18 个月无病生存率（DFS）分别为 92.1%、81.4%、33.8% 和 22.9%，表明 ACT 期间 ctDNA 持续阳性或由阴转阳是复发的强烈预测指标。该研究还提出 “ctDNA 清除” 概念，发现 ACT 与 ctDNA 清除的累积发生率更高和 DFS 延长相关。在另一项针对 III 期 CRC 的研究中，Henriksen 等人将 ACT 期间 ctDNA 水平的指数变化分为每月增加 143% 的快速增长模式和每月增加 25% 的缓慢增长模式，结果显示快速增长模式与复发和较短的总生存期（OS）相关。此外，多项正在进行的临床研究，如 IMPROVE、IMPROVE - IT2、PEGASUS 和 NRG - GI005 等，正在探索 ctDNA 在指导辅助治疗方案初始选择和治疗期间调整中的作用。对于 LARC 的新辅助治疗（NAT），总新辅助治疗策略已成为当前主要推荐方法，精确的基线风险分层以指导个体化 NAT 是研究重点。目前，ctDNA 单独用于 “观察等待” 策略评估肿瘤残留存在灵敏度局限，未来研究应致力于提高 ctDNA 的灵敏度和特异性，整合多组学、临床病理学和影像学信息，以更好地预测肿瘤完全缓解，优化 “观察等待” 方法。
7. ctDNA 分析在转移性疾病中的作用
在转移性结直肠癌（mCRC）患者中，基线时 ctDNA 分析有助于风险分层。例如，PLACOL 研究表明，基线 ctDNA 水平低于 0.1ng/ml 的 mCRC 患者接受一线或二线化疗时，治疗反应更好，总生存期（OS）更长。治疗过程中 ctDNA 水平的早期变化能比传统影像学方法更早反映治疗效果，有助于及时调整治疗策略。ctDNA 还能提供比组织活检更全面、详细的分子信息，在抗 EGFR 治疗中，多项研究验证了通过 ctDNA 分析确定 RAS 状态的可行性，且 ctDNA 可揭示靶向治疗的耐药机制，为后续治疗方案的选择提供依据。
8. ctDNA 分析在 CRC 免疫治疗中的作用
免疫治疗已成为 dMMR/MSI - H 和 / 或 TMB - H CRC 的首选治疗方法之一。多项研究探索了 ctDNA 在免疫治疗中的价值。在一项概念验证研究中，Cabel 等人评估了 ctDNA 对接受 nivolumab 或 pembrolizumab 治疗患者（包括 MSI CRC 患者）治疗反应的监测作用，发现第 8 周 ctDNA 水平变化与肿瘤大小变化显著相关，第 8 周 ctDNA 检测不到的患者治疗反应显著且持久，ctDNA 状态是无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）的重要预测指标。INSPIRE 研究对 94 例接受 pembrolizumab 治疗的晚期实体瘤患者进行连续 ctDNA 评估，结果显示 ctDNA 水平早期升高可 100% 预测免疫治疗无反应，治疗期间 ctDNA 清除的患者 OS 率为 100%，而 ctDNA 水平升高表明无客观反应。此外，bTMB 和基于 ctDNA 的 MSI（bMSI）的应用价值受到越来越多关注。CO.26 试验表明，bTMB，尤其是来源于克隆和亚克隆突变的 bTMB，可能是识别可能对免疫治疗有反应的 CRC 患者的有用生物标志物，而传统基于组织的 TMB 未显示出这种效果。在 ARETHUSA 试验中，对 MGMT 甲基化的 mCRC 患者进行预处理后，通过组织活检和 ctDNA 分析发现，经替莫唑胺（TMZ）治疗后，患者的突变特征发生改变，bTMB 增加，部分具有特定突变的患者接受 pembrolizumab 治疗后病情稳定。还有研究表明，bMSI 检测可可靠识别能从免疫治疗中受益的 MSI - H 患者。目前，ctDNA 分析在临床实践中的主要问题是 “低释放者”，可能导致风险分层假阴性和治疗决策错误。未来可通过提高 ctDNA 分析方法的灵敏度、结合浆膜腔积液检测和建立优化的分层策略来改善。
9. 结论与展望
ctDNA 作为液体活检中具有重要价值的生物标志物，在 CRC 管理中展现出巨大潜力，可提供无创、实时、动态和全面的肿瘤负担评估，有效监测癌症进展和治疗反应，为精准治疗提供关键分子遗传信息。然而，ctDNA 分析面临生物特性复杂和技术局限等挑战，包括样本处理、检测方法和数据解释等方面，需要进一步优化和标准化，并通过大规模临床研究进行验证。随着技术的不断进步和研究的深入，ctDNA 有望在 CRC 管理的更多临床场景中发挥更重要的作用。
