大型溞全基因组 DNA 甲基化模式与年龄关联的深度剖析：对无脊椎动物表观遗传学的新认知

《Epigenetics & Chromatin》：Genome-wide DNA methylation patterns in Daphnia magna are not significantly associated with age

为探究大型溞（Daphnia magna）DNA 甲基化靶向及与年龄的关联，研究人员培养不同年龄样本进行全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）。结果发现其整体 DNA 甲基化水平低，且与年龄无显著关联。该研究增进了对无脊椎动物表观遗传学的理解。

　　在生物的奇妙世界里，大型溞作为生态和进化研究中的 “明星” 生物，一直备受关注。它就像一个微观世界的 “小透明”，却蕴含着许多生物学的奥秘。DNA 甲基化，这个在基因调控和表观遗传中起着关键作用的 “神秘开关”，在大型溞身上的研究却还远远不够。以往对于大型溞 DNA 甲基化景观以及与年龄相关的表观遗传变化，科学家们了解得并不全面。有的研究在分析甲基化时，只是简单地对不同基因的外显子进行平均计算，忽略了单个基因和外显子精细的甲基化模式差异。而且，之前构建的大型溞表观遗传时钟也存在缺陷，样本年龄跨度大、包含不同品系，使得预测准确性大打折扣 。所以，为了深入了解大型溞的 DNA 甲基化情况，来自美国加利福尼亚大学洛杉矶分校、意大利帕尔马大学、美国东田纳西州立大学、美国哈佛医学院的研究人员展开了一项重要研究。
他们的研究成果发表在《Epigenetics & Chromatin》杂志上，这一研究为我们理解无脊椎动物的表观遗传学提供了新的视角，有助于揭示 DNA 甲基化在大型溞生长发育过程中的作用机制。
研究人员为了完成这项研究，使用了多种关键技术方法。首先，他们精心培养了 17 个不同年龄的大型溞样本，这些样本均来自瑞士巴塞尔大学 Ebert 实验室的耐热克隆 IL - MI - 8。接着，对样本进行全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS），该技术能够精准地检测 DNA 甲基化情况。之后，运用多种生物信息学工具对测序数据进行处理和分析，比如用 BSBolt Index tool 构建比对索引，用 samtools 去除 PCR 重复等，从多个层面深入探究大型溞的 DNA 甲基化模式。
下面来看具体的研究结果：

1. 大型溞拥有三种 DNA 甲基转移酶：通过与其他生物的 DNA 甲基转移酶（DNMT）进行同源性对比，研究人员发现大型溞有两种功能性和一种非功能性的 DNMT。其中，非功能性的 DmaDNMT3.1 在老年组表达较高，但由于缺少关键甲基转移酶基序，对甲基化水平影响不大；而功能性的 DmaDNMT1 和 DmaDNMT3.2 表达水平较低，且在不同年龄组无显著差异。
2. 高覆盖度的大型溞甲基组：对两个 45 天龄的样本进行全基因组亚硫酸氢盐测序，经过一系列严格的数据处理和筛选，最终确定了高质量的甲基化位点用于后续分析。同时，通过多种方法验证了线粒体基因组作为非转化假象阴性对照的可靠性，还发现核线粒体序列（nuMT）会对数据解释产生影响 。
3. 大型溞 DNA 的 CpG 位点甲基化水平较低：整体上，大型溞的 CpG 位点平均甲基化水平约为 2%，显著高于非 CpG 位点。在不同的基因组元件中，大多数重复元件呈现低甲基化状态。
4. 大型溞 DNA 的 CpG 位点在转录起始位点（TSS）上游低甲基化：在基因层面，非 CpG 位点在基因及近端区域甲基化水平较为均匀，而 CpG 位点在 TSS 上游几百个碱基处甲基化水平最低，下游则显著升高，在基因内部逐渐降低，并且不同甲基化水平的基因功能存在差异 。
5. 大型溞外显子 CpG 位点比相邻内含子区域甲基化程度更高：外显子的甲基化密度更高，平均甲基化率约为 0.17%，而内含子仅为 0.07%。在多外显子基因中，外显子的甲基化水平随位置变化，Exon 1 在 3’端附近甲基化水平达到峰值 。
6. 大型溞的整体和局部 CpG 甲基化模式与年龄关联较弱：从全球分析来看，不同年龄组的 CpG 甲基化水平无显著差异，UMAP 可视化也未显示出与年龄相关的聚类。在基因水平上，虽然有甲基化随年龄下降的趋势，但随机排列检验表明差异不显著，也未发现与年龄显著相关的区域或基因。
   在研究结论和讨论部分，研究人员发现大型溞的 DNA 甲基转移酶具有独特性，其低甲基化水平的原因可能与 DmaDNMT1 表达降低和某些结构域缺失有关，但具体因素仍不明确。大型溞基因体甲基化水平略高于整体水平，不过低于其他一些无脊椎动物，这可能与 DNMT3.2 中 PWWP 结构域缺失有关。此外，大型溞在 TSS 上游低甲基化、外显子高甲基化的模式与其他生物存在相似性 。值得注意的是，大型溞的 DNA 甲基化与年龄的关联并不紧密，这与脊椎动物形成鲜明对比，并且构建表观遗传时钟的尝试也失败了，这表明在无脊椎动物中构建可靠的表观遗传时钟还面临诸多挑战。不过，研究人员也观察到大型溞随着年龄增长，CpG 位点甲基化水平有轻微下降的趋势，这与其他无脊椎动物在发育过程中的表观遗传变化类似 。
   总的来说，这项研究全面地描绘了大型溞的 DNA 甲基化景观和 DNMT 酶的特征，强调了其外显子偏向的 CpG 甲基化模式。研究结果表明，DNA 甲基化在大型溞衰老过程中的作用可能较为有限，这一发现为无脊椎动物表观遗传学研究开辟了新的方向，也为后续进一步研究 DNA 甲基化、环境因素和基因调控之间的相互作用奠定了重要基础。