DNM1L 介导的线粒体裂变在成肌分化中调控线粒体自噬与生物发生的关键作用

《Cell Communication and Signaling》：DNM1L-mediated fission governs mitophagy & mitochondrial biogenesis during myogenic differentiation

为探究线粒体裂变在成肌分化中对其他线粒体重塑过程的调控作用，以及增强线粒体自噬或生物发生能否恢复裂变缺陷状态下的成肌分化，研究人员以 C2C12 成肌细胞为对象开展研究。结果表明线粒体裂变对成肌分化至关重要，相关发现为肌肉疾病治疗提供新方向。

　　在细胞的成长历程中，就如同一场精密的交响乐演奏，各种生理过程有条不紊地进行着。其中，细胞分化这一乐章尤为关键，它让细胞从 “青涩” 走向 “成熟”，具备特定的功能。而线粒体，作为细胞的 “能量工厂”，在这个过程中发挥着不可或缺的作用。在肌肉细胞的分化过程中，线粒体需要不断地进行重塑，以满足新形成的肌管日益增长的能量需求。线粒体的裂变、自噬和生物发生等过程，就像是工厂里的一道道工序，相互协作，共同维持着线粒体的正常功能。

然而，目前科学家们对于这些线粒体重塑过程之间的精确机制和相互关系还知之甚少。就好比在一座复杂的工厂里，虽然知道各个车间都很重要，但却不清楚它们之间是如何协同工作的。正是在这样的背景下，加拿大滑铁卢大学（University of Waterloo）的研究人员决定深入探索这个神秘的领域，试图揭开线粒体重塑与成肌分化之间的奥秘。他们的研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》上，为我们理解这一过程提供了重要的线索。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是细胞培养技术，使用 C2C12 小鼠成肌细胞，通过特定的培养基进行培养，并诱导其分化；其次是基因编辑技术，利用 CRISPR/Cas9 技术敲除 C2C12 细胞中的 Bnip3 基因；还有病毒介导的基因转移技术，通过腺病毒转导的方式改变细胞中关键分子的表达水平；最后，运用免疫印迹、免疫细胞化学、流式细胞术、共聚焦显微镜等多种检测技术，对细胞的各项指标进行分析。

研究结果如下：

1. DNM1L 过表达促进线粒体碎片化、增加线粒体自噬通量并减小肌管大小：研究人员通过将 Ad - Dnm1l 或对照病毒（AdLacZ）转导到细胞中，发现 DNM1L 过表达（OE）会导致线粒体明显碎片化，在分化早期（D0 和 D1），线粒体网络分支数和连接数显著减少，同时线粒体自噬通量在早期显著增加。到了 D2，线粒体网络似乎恢复正常，线粒体自噬通量也有所下降。此外，DNM1L OE 虽然没有改变线粒体质量（通过 MitoTracker green 检测）和线粒体膜电位（通过 TMRE 检测），但却降低了线粒体对 Calcein - AM 荧光的保留，这表明诱导了线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放。有趣的是，这还伴随着 D1 时半胱天冬酶 9（CASP9）活性的降低，而半胱天冬酶 3（CASP3）和钙蛋白酶（CAPN）活性不受影响。在肌管形成方面，DNM1L OE 显著减小了 D5 时肌管的大小，但对分化和融合指数没有影响。同时，研究还发现 DNM1L OE 与线粒体生物发生相关蛋白（如 PPARG 共激活因子 1α，PPARGC1A）和线粒体自噬相关蛋白（如 BNIP3、BNIP3L 和 PINK1）的表达没有改变，但会导致新形成的肌管中线粒体电子传递效率和抗氧化能力受损，相关蛋白细胞色素 c（CYCS）和超氧化物歧化酶 2（SOD2）的水平在 D3 和 D5 降低。
2. DNM1L 缺失损害线粒体自噬通量、限制成肌分化并增加线粒体凋亡信号：研究人员利用腺病毒敲低（KD）DNM1L，结果发现 DNM1L KD 增加了线粒体分支数和连接数，抑制了 D0 和 D1 时的线粒体自噬通量。同时，线粒体质量（MTG 荧光增加）增加，但线粒体膜电位没有改变。此外，DNM1L KD 还增加了线粒体对 Calcein - AM 的保留，表明 MPTP 开放减少。在细胞凋亡方面，DNM1L KD 导致 D1 时 CAPN 活性降低，而 CASP9 和 CASP3 活性显著升高。在成肌分化方面，DNM1L KD 显著降低了 D5 时肌管的大小、分化和融合指数，同时还降低了关键重塑分子 PPARGC1A 和 BNIP3 的表达，尽管 PINK1 在 D5 有所增加。
3. BNIP3 过表达促进裂变缺陷成肌细胞分化过程中的线粒体自噬通量并抑制线粒体凋亡信号：在发现 DNM1L 对线粒体自噬和肌肉生成至关重要后，研究人员探究了过表达关键线粒体自噬受体 BNIP3 的作用。在 DNM1L KD 细胞中过表达 BNIP3，结果显示 BNIP3 OE 能够促进线粒体自噬，在 D0、D1 和 D2 时线粒体自噬通量显著增加。同时，BNIP3 OE 还略微减少了 D0 和 D1 时每个细胞的线粒体分支数，增加了线粒体质量（MTG 荧光增加），降低了 D1 时的线粒体膜电位（TMRE 荧光降低）。此外，BNIP3 OE 还降低了 D1 时 CASP3 和 CASP9 的活性，但对线粒体 Calcein - AM 保留（即 MPTP 开放）和 CAPN 活性没有影响。然而，BNIP3 OE 并没有影响肌管的大小、分化或融合指数，也没有显著改变整体自噬的参数，并且在分化的中晚期降低了 PPARGC1A 的表达。
4. PPARGC1A 过表达加剧裂变缺陷细胞的成肌缺陷：考虑到成肌过程伴随着显著的线粒体重塑，研究人员想知道过表达线粒体生物发生的主调节因子 PPARGC1A 是否能克服线粒体裂变和自噬缺陷。结果令人惊讶，在裂变缺陷细胞中过表达 PPARGC1A 显著加剧了成肌缺陷，导致 D5 时肌管大小、分化和融合指数降低。同时，PPARGC1A OE 还导致自噬体蛋白 LC3B - I 和 LC3B - II 在早期升高，但 SQSTM1 仅在 D0 略有降低，LC3B - II:I 比值仅在 D0 升高。此外，PPARGC1A OE 还增加了线粒体自噬受体 BNIP3 和 BNIP3L 的表达，以及线粒体动态蛋白 OPA1 和 MFN2 等相关蛋白的表达。
5. 增强的线粒体自噬通量和裂变不足以恢复 Bnip3 敲除细胞的成肌分化：研究人员进一步探究增强的线粒体裂变是否能独立于 BNIP3 介导的线粒体自噬改善线粒体重塑并恢复成肌分化。在 Bnip3 敲除（Bnip3^-/-）细胞中过表达 DNM1L，结果发现 DNM1L OE 减少了线粒体分支数，增加了分化成肌细胞在 D1 和 D2 时的线粒体自噬通量。同时，DNM1L OE 还降低了线粒体质量（MTG 荧光降低）、线粒体膜电位（TMRE 荧光降低），降低了 CASP3、CASP9 和 CAPN 的活性，减少了线粒体 MPTP 开放。然而，DNM1L OE 并没有恢复 Bnip3^-/-细胞在肌管大小、分化或融合指数方面的缺陷。

研究结论和讨论部分表明，线粒体重塑过程对于成肌分化至关重要，并且必须按照特定的顺序发生。线粒体裂变在调节线粒体自噬和肌肉生成的进程中起着关键作用，增强线粒体自噬或生物发生单独无法恢复与裂变缺陷相关的成肌缺陷，这突出了在成肌分化过程中线粒体裂变的必要性。此外，研究还发现 BNIP3 在调节成肌分化方面可能具有超越其在线粒体自噬中作用的功能。这项研究为理解成肌分化的细胞机制提供了新的视角，也为治疗线粒体功能障碍相关的肌肉疾病提供了潜在的治疗策略，强调了恢复或增强线粒体重塑自然序列的重要性，有望通过靶向调节线粒体动态来促进肌肉修复和功能恢复。