基于纳米孔技术的便携式基因分型平台用于小麦秆锈菌谱系及杀菌剂敏感性的近实时检测

《BMC Genomics》：A portable, nanopore-based genotyping platform for near real-time detection of Puccinia graminis f. sp. tritici lineages and fungicide sensitivity

当前真菌植物病害频发，严重威胁农业生态系统和粮食安全，其中小麦秆锈菌（Puccinia graminis f.sp. tritici，Pgt）危害巨大。研究人员开发了基于纳米孔测序的 Pgt 分型平台（MARPLE）。该平台能快速分型 Pgt 菌株并监测杀菌剂敏感性变化，有助于防控 Pgt 病害。

　　在广袤的农田里，小麦作为全球重要的粮食作物，养活了无数人口。然而，一种名为小麦秆锈菌（Puccinia graminis f.sp. tritici，Pgt）的真菌却如潜伏的恶魔，严重威胁着小麦的产量和质量。近年来，真菌植物病害爆发的规模和频率不断增加，Pgt 更是从农业诞生之初就开始威胁小麦生产。新的 Pgt 菌株持续出现，通过无性夏孢子的空气传播迅速扩散，常常突破新受影响地区主要作物品种的抗性，引发大规模病害爆发。例如，2013 - 2014 年，埃塞俄比亚因一种 “新” 的 Pgt 小种入侵，全国小麦产量损失至少 15%。面对如此严峻的形势，开发一种即时、实时的 Pgt 基因分型平台迫在眉睫。

为了解决这一难题，来自 John Innes Centre、Kenya Agricultural and Livestock Research Organization 等多个机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《BMC Genomics》上，为防控 Pgt 病害带来了新的希望。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先是比较基因组分析，对 86 个全球 Pgt 分离株的基因组和转录组数据进行分析，筛选出多态性基因。然后运用引物设计技术，针对目标基因设计特异性引物。在测序环节，利用 MinION 纳米孔测序仪对样本进行测序。最后通过生物信息学分析，构建系统发育树，确定 Pgt 分离株的遗传关系。

研究结果如下：

1. 全球 Pgt 分离株的遗传多样性：通过对 165 个全球 Pgt 数据集的分析，发现全球 Pgt 分离株高度多样化，可分为 12 个不同的遗传组。这些分离株在地理上广泛分布，且部分遗传组的菌株出现了复苏现象。
2. 多态性基因用于定义 Pgt 谱系：评估了已有的 Pst 多态性基因集，发现基因长度和扩增成功率的关系，确定了选择 Pgt 标记基因的标准。经过筛选，确定了 392 个高度多态性的 Pgt 基因，其中 276 个基因的序列足以区分 Pgt 谱系。
3. 276 个 Pgt 基因的特征：这些基因均匀分布在 Pgt 基因组中，大多编码功能未知的蛋白质。其中一些基因编码的蛋白质具有水解酶活性，部分还可能是效应蛋白。
4. MARPLE 诊断平台的应用：在肯尼亚和埃塞俄比亚对 Pgt 感染的小麦样本进行检测，结果表明该平台能在资源有限的地区快速将样本分配到已知的 Pgt 小种组，且基因扩增效率高。
5. 杀菌剂靶基因的整合：将杀菌剂靶基因（Cyp51、SdhA、SdhB、SdhC 和 SdhD）整合到 Pgt MARPLE 诊断平台，优化了引物池，能够检测与杀菌剂敏感性相关的突变。

研究结论和讨论部分指出，该研究开发的 Pgt MARPLE 诊断平台是首个可直接从田间采集的 Pgt 感染小麦样本进行菌株水平诊断的便携式系统，能在 2 天内得出结果。同时，该平台监测杀菌剂靶基因的突变，为杀菌剂敏感性下降提供早期预警，便于及时干预。此外，该研究为其他复杂真菌威胁的诊断和监测平台开发提供了框架，随着先进的基于基因组的诊断工具越来越多地融入国家监测计划，有望减少 “谷物杀手” 造成的巨大损失。