工程改造布拉氏酵母以增强其表面展示能力：构建更优的益生菌载体平台

《Microbial Cell Factories》：Engineering Saccharomyces boulardii for enhanced surface display capacity

为解决布拉氏酵母（Sb）表面展示效率未被充分优化的问题，研究人员开展了优化 Sb 展示系统的研究。通过改造展示盒组件和宿主菌株，构建出 LIP02 菌株，其展示能力显著提升，且展示的 β - 葡萄糖苷酶功能得以保留，为治疗蛋白表达提供了更稳定高效的平台。

　　在微生物的奇妙世界里，酵母作为一种重要的微生物，在生物技术领域发挥着独特的作用。其中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）因具有 Generally Recognized as Safe（GRAS）的特性以及丰富的基因组工程工具，一直是酵母表面展示的常用宿主。然而，对于关注人类健康的应用场景而言，布拉氏酵母（Saccharomyces boulardii，Sb）凭借其益生菌特性，如抵御病原体定植、免疫调节以及调节共生微生物群等，成为了极具潜力的酵母表面展示宿主替代选择。

尽管如此，目前针对 Sb 表面展示系统的研究却十分有限。一方面，虽然基于 Sc 设计的酵母展示系统可转移至 Sb，但现有的 Sb 展示系统存在诸多不足。例如，常用的 Aga1 - Aga2 系统在还原环境下，二硫键不稳定，会导致蛋白结构不稳定和功能改变，影响益生菌菌株的功效。另一方面，缺乏优化的 Sb 展示系统严重限制了其作为功能性蛋白展示宿主的潜力。为了突破这些困境，开发一个性能优良的 Sb 展示平台显得尤为重要。

在此背景下，来自普渡大学（Purdue University）的研究人员开展了一项旨在优化 Sb 展示系统的研究。他们通过一系列实验，成功构建出一株优化的 Sb 菌株 LIP02，并对其进行了多方面的评估，包括蛋白表达水平、展示效率、展示蛋白的功能以及宿主适应性等。该研究成果发表在《Microbial Cell Factories》杂志上，为酵母表面展示技术的发展和应用带来了新的突破。

研究人员在开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。在基因编辑方面，借助 CRISPR/Cas9 技术对宿主菌株进行精准改造，如敲除特定基因和过表达相关基因。同时，利用质粒构建技术，构建携带不同展示盒的质粒，用于评估不同组件对展示效率的影响。此外，还运用了流式细胞术来分析蛋白的表达和展示水平，通过该技术可以准确地检测到荧光信号，从而判断展示效率的高低。

研究结果如下：

• Sc 展示系统可转移至 Sb：研究人员测试了在 Sc 中广泛使用的 Aga2p 和 Sed1p 锚定系统在 Sb 中的适用性。通过流式细胞术分析发现，Sc 在基于 Aga2 和 Sed1 的系统中展示效率均优于 Sb。不过，这一结果也验证了展示盒的设计，表明两种系统都能与 Sb 兼容。
• 优化 Sb 展示盒：在 Aga2 - Aga1 系统中，含有 G4S 接头的质粒 A2 比不含接头的 A1 展示水平更高，说明接头能增强表达和展示。对于 Sed1 基展示系统，研究人员评估了锚定长度的影响。结果显示，全长 SbSed1p 的展示效率明显优于截短的锚定。此外，还发现当与全长 SbSed1p 配对时，MFαsp 比 Sed1sp 能赋予更高的展示效率。基于这些结果，选择 A2 和 S1 作为后续实验的展示盒。
• 宿主改造增强展示能力：研究人员通过过表达 AGA1、敲除 CCW12 和 CCW14 构建了 LIP01 菌株，在此基础上进一步敲除 FYV5 得到 LIP02 菌株。实验表明，LIP02 在基于 Aga2 和 Sed1 的展示系统中均表现出比亲本菌株更高的展示水平。同时，LIP02 细胞大小和密度发生了变化，在相同 OD₆₀₀值下，其干重（DCW）和细胞浓度（CFU/mL）更低。
• 展示盒整合到 LIP02 基因组：与基于质粒的表达系统相比，将展示盒 A2 整合到 LIP02 基因组后，菌株稳定性增强，展示水平显著提高。通过共聚焦显微镜观察发现，LIP02 的细胞形态更清晰，展示效率得到进一步证实。
• 工程改造的 Sb 菌株保持酶功能：研究人员将来自棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）的 β - 葡萄糖苷酶（aaBGL）展示在 LIP02 表面，评估宿主改造对展示蛋白功能的影响。结果显示，LIP02 展示 aaBGL 的荧光阳性细胞百分比更高，细胞对纤维二糖的降解速度更快，在 24 h 时的比纤维二糖消耗速率提高了两倍，这表明 LIP02 在展示能力提升的同时，保留了展示蛋白的功能。

研究结论和讨论部分指出，本研究通过优化展示盒和改造宿主菌株，成功构建了具有增强展示能力的 Sb 菌株 LIP02。在展示盒方面，不同锚定类型、长度、信号肽和接头设计都会影响展示效率，这为后续进一步优化展示系统提供了重要参考。宿主菌株的改造，如 AGA1 的过表达、CCW12 和 CCW14 的敲除以及 FYV5 的缺失，有效地增加了蛋白展示的 docking 位点，优化了蛋白分泌和展示过程。此外，基因组整合展示盒解决了质粒表达系统的稳定性问题，使菌株能够在非选择性培养基中生长。然而，使用基因改造的益生菌菌株面临着严格的监管限制，未来需要重点评估 LIP02 在体内的稳定性、在不同发酵条件下的稳定性以及对免疫原性和治疗效果的影响。总体而言，该研究为开发强大的治疗菌株奠定了基础，为酵母表面展示技术在生物医学和临床应用中的进一步发展提供了重要的理论和实践依据。