综述：细胞外颗粒：中枢神经系统疾病的新见解

《Journal of Nanobiotechnology》：Extracellular particles: emerging insights into central nervous system diseases

这篇综述聚焦细胞外颗粒（EPs）在中枢神经系统（CNS）疾病中的作用。EPs 包括细胞外囊泡（EVs）和非囊泡细胞外颗粒（NVEPs），文中阐述其异质性、在疾病病理中的作用、作为生物标志物及治疗载体的潜力，还探讨面临的挑战与未来方向，值得一读。

　　

引言

在神经科学突破和全球人口老龄化的双重推动下，中枢神经系统（CNS）疾病已成为 21 世纪重大的医疗危机。据《柳叶刀神经病学》数据，2021 年全球约 34 亿人受神经系统疾病影响，占全球人口的 43.1%，导致 4.43 亿伤残调整生命年的损失，超越心血管疾病成为全球疾病负担的首要原因。神经退行性疾病（NDs），如阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD），在老龄化的亚太地区呈指数增长，每年造成超 2.5 万亿美元的经济损失，且当前治疗存在诸多局限，97% 的神经治疗药物因血脑屏障（BBB）的不可渗透性在临床试验中失败。

细胞外颗粒（EPs），包括细胞外囊泡（EVs）和非囊泡细胞外颗粒（NVEPs），作为细胞释放的多分子生物材料，在细胞间通讯中发挥关键作用。近年来，与 CNS 相关的新型 EPs 亚型，如外吐体（exophers）和超微粒（supermeres）被相继发现，为理解 CNS 疾病的病理进展提供了新视角，在神经退行性疾病的液体活检中具有潜在诊断价值，同时也成为有前景的药物递送载体和 CNS 特异性治疗的靶向平台。本文将系统阐述 EPs 亚型的特征及其在 CNS 疾病病理生理学中的作用，回顾基于 EPs 的神经退行性疾病诊断的最新进展，强调单颗粒分辨率分析平台在开发潜在生物标志物中的重要性，总结工程化 EVs 在 CNS 疾病治疗中的应用，并探讨 NVEPs 作为新型治疗剂的潜在价值。

EVs 和 NVEPs 的异质性

过去十年，技术和方法的进步以及对 EPs 复杂性和异质性的深入理解，促使众多新型 EPs 亚型被发现。EPs 的异质性和复杂性源于细胞类型和功能状态的多样性，以及多种分泌途径的共同作用。尽管对不同 EPs 亚型形成的研究不断深入，但它们的起源、运输和释放的精确机制仍未完全明晰。

EVs 亚型

基于起源和形成过程，EVs 主要分为三种亚型：凋亡小体或凋亡小泡、外切体（ectosomes）和外泌体（exosomes）。近期研究表明，具有双膜结构的线粒体衍生囊泡（mitovesicles）因其独特的生物发生过程，也被视为一种新的 EVs 亚型。

• 外泌体：外泌体的生物发生始于早期分选内体（ESEs）的形成，ESEs 通过内吞作用包裹细胞外成分和膜蛋白，随后可成熟为多泡体（MVBs）。MVBs 与细胞膜融合，将内部的小囊泡（ILVs）释放到细胞外空间，即为外泌体。外泌体生物发生的每个阶段都受多种机制调控，涉及竞争或协调，导致不同外泌体亚群含有独特的分子货物，使得外泌体本身具有显著的异质性。因此，研究人员越来越多地运用单囊泡技术，如超分辨率显微镜和纳米流式细胞术，来解析外泌体的异质性。
• 凋亡小体或凋亡小泡：凋亡小体是细胞凋亡过程中形成的直径约 1000 - 5000nm 的囊泡，其形成涉及一系列凋亡分子和信号通路，包括凋亡信号转导的启动、半胱天冬酶的激活及其下游级联反应，以及细胞核的碎片化。在凋亡后期，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内层重新分布到外层，最终形成囊泡结构。细胞在凋亡过程中还会释放较小的凋亡小泡（100 - 1000nm），这些小泡不仅携带特定的凋亡标记物如 PS 和 Fas，还含有外泌体标记物如 CD63，暗示 MVBs 可能参与其生物发生。
• 外切体：外切体通过质膜出芽和起泡产生，包含多种亚型，如微囊泡（microvesicles）、含抑制蛋白结构域蛋白 1 介导的微囊泡（ARMMs）、纤毛外切体（ciliary ectosomes）、外吐体（exophers）、大肿瘤体（large oncosomes）和迁移体（migrasomes）。微囊泡被视为 “标准” 的外切体，表达膜联蛋白 A1 和 A2，直径在 150 - 1000nm 之间。ARMMs 与微囊泡的区别在于其出芽过程由位于质膜胞质侧的 ARRDC1 蛋白引导，ARRDC1 通过四肽基序招募 ESCRT - I 复合物蛋白 TSG101 到细胞表面，启动 ARMMs 向外膜的出芽。纤毛外切体从纤毛的质膜释放，丝状伪足衍生的外切体则源于细胞的指状膜突起丝状伪足，在氧化应激下形成，可传播氧化应激并导致细胞死亡，尤其是对线粒体的损伤。迁移体是近年来发现的在迁移细胞的收缩纤维上形成的囊泡，可能源于迁移性胞质分裂。外吐体是秀丽隐杆线虫神经元在神经毒性应激下分泌的巨大膜囊泡（直径约 4μm），作为一种解毒机制，排出聚集的蛋白质（如多聚 Q 聚集体）和受损的细胞器（如功能失调的线粒体），保护神经元健康。
• 线粒体衍生囊泡：线粒体衍生囊泡是一种新发现的源于线粒体的细胞外囊泡亚型，具有独特的双膜结构。它首次在对小鼠和人类大脑分离的 EVs 进行高分辨率密度梯度分离时被发现，尤其在唐氏综合征（DS）和二倍体对照研究中。与其他 EVs 不同，线粒体衍生囊泡直接来源于线粒体成分，其生物发生可能与衰老和神经退行性疾病中的线粒体功能障碍和内溶酶体异常有关。线粒体衍生囊泡在神经退行性疾病的病理生理学中发挥作用，如在 AD 和 DS 中，其丰度和货物组成发生改变，反映了潜在的线粒体损伤。在 DS 大脑中，线粒体衍生囊泡中某些线粒体蛋白和酶（如单胺氧化酶 A/B）水平失调，影响突触功能。实验表明，从 DS 模型小鼠中分离的线粒体衍生囊泡会损害长时程增强（LTP），而 MAO 抑制剂可逆转这一效应，说明线粒体衍生囊泡可传播线粒体来源的毒性因子，加剧神经元功能障碍。

NVEPs 亚型

尽管大多数关于细胞分泌 EPs 的研究集中在 EVs 上，但细胞也会释放许多由蛋白质、RNA、脂质和 DNA 组成的非囊泡细胞外颗粒（NVEPs），它们不被双层膜结构包裹。常见的 NVEPs 包括外显微粒（exomeres）、超微粒（supermeres）、细胞外立方颗粒（extracellular cuboidal particles）、穹窿体（vaults）、核小体（nucleosomes）、脂蛋白颗粒（LPPs）和 T 细胞衍生的超分子攻击颗粒（SMAPs）等。

• 外显微粒：外显微粒于 2018 年通过不对称流动场 - 流分级技术（AF4）首次被鉴定为 NVEPs 的一种亚型。2019 年，研究人员通过连续超速离心从去除 EVs 的细胞上清液中进一步纯化外显微粒，确定其大小约为 35nm（<50nm），且在透射电子显微镜下观察到无外部膜结构。蛋白质组学和脂质组学分析显示，外显微粒缺乏典型的膜相关蛋白（如 CD9、CD81、CD63）和脂质（如磷脂、鞘磷脂），与 EVs 区分开来。在癌症生物学中，肿瘤来源的外显微粒可介导全身代谢重编程，例如传递棕榈酸，诱导肝库普弗细胞的促炎反应，导致脂肪肝的发展、脂肪酸代谢抑制和药物代谢降低。在慢性甲基苯丙胺使用障碍（MUD）中，外显微粒携带与 EV 相关的 miR - 29a，这种 microRNA 在促进炎症和突触树突损伤中起关键作用，参与神经炎症和突触损伤过程。尽管外显微粒在细胞间通讯中发挥重要作用，但其生物发生和细胞摄取机制目前仍不明确。
• 超微粒：近期，研究人员通过超速离心在去除外显微粒的细胞上清液中鉴定出直径为 25 - 35nm 的 NVEPs，命名为超微粒。超微粒在大小、结构和密度方面与外显微粒具有明显差异，具有独特的蛋白质组学特征，富含 TGFBI 和一系列与疾病相关的蛋白质，包括 AGO 蛋白、淀粉样前体蛋白（APP）及其关键裂解酶 β - 位点 APP 裂解酶 1（BACE - 1）等。超微粒还可结合细胞外 RNA（exRNA），如 miRNA 和 snRNA，且 RNA 丰度较高，其中 miR - 1246 的表达水平比细胞中高 1024 倍。超微粒的生物发生可能与自噬或相分离过程有关，其富含参与伴侣介导自噬的蛋白质（如 HSPA8、HSP90），并含有可被自噬机制识别的 KFERQ 基序货物。体外细胞摄取动力学研究表明，超微粒的摄取速度比小 EVs（sEVs）慢，但在体内给药时，其摄取效率高于外显微粒和 sEVs，且能够穿过血脑屏障（BBB），而外显微粒穿透 BBB 和在大脑中吸收的能力有限。由于超微粒富含循环生物标志物，在 CNS 疾病的早期检测和监测方面具有潜在的诊断价值，为 AD 等神经退行性疾病的研究提供了新的方向。
• 其他 NVEPs：穹窿体是一种由肽自组装而成的货物递送纳米装置（41nm×72.5nm），在真核生物中广泛分布且具有高度进化保守性。研究发现，穹窿体除了在细胞死亡时被动释放外，还可通过两亲性途径主动释放。核小体由组蛋白和 DNA 组成，存在于真核生物和古细菌中，近期研究在细胞上清液的 NVEPs 组分中发现了核小体。Bálint 等人描述了一种由细胞毒性 T 淋巴细胞释放的特定类型的 NVEPs（120nm），即 SMAPs，其携带穿孔素和颗粒酶等细胞毒性物质，在免疫激活时释放，可直接结合并清除靶细胞。随着检测和分离技术的不断进步，NVEPs 的异质性逐渐被认识，基于细胞分泌组的蛋白质组学分析推测，每个细胞可能分泌超过 20 种 EPs 亚型，这表明 EPs 的复杂性和异质性可能超出目前已鉴定的亚型，为深入研究 CNS 疾病提供了更多潜在的分子靶点。

EPs 在神经退行性疾病中作为病理分子的介质

蛋白质错误折叠后的病理性沉积是许多神经退行性疾病（NDs）的常见致病机制，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）。这些错误折叠和聚集的蛋白质能够从一个或多个焦点传播到附近的神经解剖区域，而 EPs 在其中发挥着关键作用，参与错误折叠蛋白质的传递和神经退行性疾病的病理进展。

• 阿尔茨海默病：AD 是一种进行性神经退行性疾病，其病理特征为大脑皮层和皮质下灰质中 β - 淀粉样蛋白（Aβ）斑块的积累以及 tau 蛋白过度磷酸化导致的神经原纤维缠结，这些病理变化会导致大量突触和神经元丢失。Aβ 肽由 APP 经蛋白水解切割产生，APP 的细胞内运输和加工与内体囊泡循环密切相关。APP 在内体中部分切割，随后 Aβ 肽通过外泌体从细胞中释放。研究发现，AD 大脑中的 tau 丝主要由截断的 tau 组成，可选择性地包装在 EVs 中，这些 EVs 富含内溶酶体蛋白，通过特定分子相互作用将 tau 丝连接到其限制膜上，促进其类似朊病毒的传播。此外，AD 大脑来源的 EVs 富含 tau 寡聚体，优先靶向特定的神经元群体（如中间神经元），传播 tau 病理并损害突触功能。抑制外泌体合成可有效阻止这种传播。同时，EVs 还促进 Aβ 在各种脑细胞（如星形胶质细胞和小胶质细胞）之间的类似朊病毒的传播。在 AD 患者中还发现了一种新的 NVEPs 亚型 —— 细胞外立方颗粒，其存在于 β - 淀粉样蛋白斑块中，而在非痴呆个体的组织中不存在，该颗粒可能与 AD 病理或 Aβ 形成有关，为理解 AD 的发病机制提供了新的视角。
• 帕金森病：PD 的病理特征是黑质纹状体多巴胺能神经元变性、纹状体多巴胺水平显著降低以及神经元内异常的 α - 突触核蛋白（α - syn）蛋白聚集体（路易小体）的形成。具有神经毒性的寡聚 α - syn 的神经病理变化通常以特定且可预测的方式在大脑中进展，表明 PD 的进展与 α - syn 的细胞间传播有关。EVs 可将 α - syn 传递到多个脑区，加速 PD 病理进展。PD 患者的脑脊液（CSF）和血液来源的 EVs 中均含有大量 α - syn，细胞内 α - syn 的降解减少（如因溶酶体功能障碍）以及异常自噬可能是 α - syn 通过 EVs 释放的潜在机制。此外，α - syn 还可通过非经典分泌途径从 EVs 中外化释放。小胶质细胞来源的 EVs 可诱导神经元 α - syn 聚集，促进 AD 病理进展。PD 患者血液来源的 EVs 会加剧由病理性 α - syn 诱导的单核细胞和静息小胶质细胞的强烈炎症激活，进一步加重神经炎症和免疫反应，影响疾病进程。

EPs 在神经退行性疾病中的生物标志物作用

整体颗粒分析

在神经退行性疾病的早期阶段，携带病理分子的 EPs 亚型可能在病变细胞与健康细胞之间的通讯中发挥重要作用。部分 EPs 亚群，如超微粒，能够轻易穿过血脑屏障（BBB），这种异质性和可获取性为疾病的筛查和诊断提供了宝贵机会。对整体 EPs 进行蛋白质组学、RNA 组学和代谢组学分析，有助于深入了解神经退行性疾病中 EPs 的变化，推动其作为潜在诊断标志物的发展。例如，脑来源的 EVs 中疾病相关 miRNA 水平上调，且与外周 EVs 的特征相关，有望成为 AD 早期检测的 “液体活检” 指标。对血浆中神经元富集的 EVs（如 p - tau、Aβ42 和 pIRS - 1 水平升高）进行纵向分析，显示出对临床前 AD 诊断的预测价值，具有较高的准确性和临床相关性。蛋白质组学研究还发现了新的 EV 相关蛋白（如 ANXA5 和 VGF），进一步拓展了对 EV 在 AD 中作用机制的理解。在 PD 患者中，星形胶质细胞来源的携带 α - synuclein 的 EVs 显著增加，其水平与溶酶体功能障碍相关，且在区分 PD 与其他 α - synucleinopathies 方面具有较强的诊断能力。

单颗粒分析

EPs 的异质性和体液成分的复杂性给基于 EPs 的诊断带来了挑战。近年来，单颗粒技术的发展显著提升了对 EPs 的详细分析能力，尤其是在神经退行性疾病研究中。单囊泡技术能够克服整体 EV 分析的局限性，如避免囊泡群体间细微分子差异的丢失，准确识别携带疾病相关生物标志物的特定 EV 亚群，更符合神经退行性疾病多因素和高度个体化的特点，为诊断和个性化医疗提供更精细的方法。纳米流式细胞术和增强等离子体检测技术显著提高了 EV 生物标志物检测的灵敏度和特异性，能够区分 AD、轻度认知障碍（MCI）和健康对照。AD 血浆 EVs 中磷酸化 tau 蛋白（P - TS235、p - TS396、p - TS404）和 Aβ42 水平高于 MCI，这些生物标志物联合使用（如 p - tauS235 与 Aβ42），通过纳米流式细胞术（nFC）在区分 AD 与健康对照时可达到较高的诊断准确性（AUC 0.989），且无需分离 EVs。邻近条形码检测（PBA）技术通过对尿液等非侵入性生物流体中的单 EV 表面蛋白进行多重分析，为 AD 诊断带来了变革。该技术识别出 183 种蛋白质，并突出了特定的尿液 EV 亚群（如以 PLAU、ITGAX 和 ANXA1 为标记的亚群），诊断准确率达到 88%。PBA 技术与机器学习的无缝集成，提高了诊断的准确性和可扩展性，同时揭示了疾病特异性的 EV 特征，对 AD 和其他神经退行性疾病的早期检测具有重要意义。此外，EV 识别和检测生物芯片（EVID - biochip）能够高效地从血清中分离和定量 L1CAM 阳性的神经元 EVs，为区分 PD 与健康对照提供了快速、微创且诊断准确性高（AUC = 0.973）的平台。深度学习算法和超分辨率显微镜（SRM）等新型成像技术的发展，有助于更全面地理解 PD 的异质性进展，为靶向干预和精准的患者分层奠定基础。尽管单颗粒技术取得了显著进展，但仍面临成本高、技术复杂和平台间缺乏标准化等问题，限制了其大规模临床应用，不过随着生物信息学、自动化技术的发展以及与其他互补技术的整合，有望克服这些障碍。

EPs 在 CNS 损伤中的双刃剑作用

急性 CNS 损伤，如中风、创伤性脑损伤（TBI）和脊髓损伤（SCI），会导致大量细胞死亡，引发炎症和继发性损伤。EPs<