结肠吻合口愈合与渗漏的小鼠模型中肠道各层特异性分子特征：开启精准诊疗新征程

《Molecular Medicine》：Layer-specific molecular signatures of colon anastomotic healing and leakage in mice

为解决结肠吻合口渗漏（CAL）这一术后严重并发症机制不明的问题，研究人员开展了对小鼠结肠吻合口组织不同肠层在愈合各阶段转录谱的研究。结果发现黏膜 / 黏膜下层（M/SM）和肌层（ME）愈合阶段大多同步，M/SM 转录谱可区分 CAL 和结肠吻合口愈合（CAH）。这为探究 CAL 机制及寻找生物标志物提供依据。

　　在结直肠手术中，当病变组织被切除后，肠道的连续性需要通过吻合手术来恢复。然而，术后结肠吻合口愈合（CAH）却常常出现问题，结肠吻合口渗漏（CAL）这一并发症的发生率在 1 - 19%。CAL 会导致腹腔感染、脓肿形成，甚至引发败血症，严重影响患者的预后和生活质量。尽管手术技术和围手术期管理不断进步，但 CAL 的发生率在过去几十年里并未明显下降。这是因为目前对 CAH 的机制了解不足，现有研究大多是从皮肤伤口愈合的研究中进行推断，忽略了皮肤和肠道伤口愈合的差异，而且很少有研究关注肠道不同层在愈合过程中的具体作用。

为了深入探究 CAH 和 CAL 的机制，德国波恩大学医院（Department of Surgery, University Hospital of Bonn）、阿姆斯特丹大学医学中心（Amsterdam UMC - University of Amsterdam）等机构的研究人员开展了一项重要研究。他们通过构建小鼠结肠吻合模型，对术后不同时间点吻合口组织的黏膜和黏膜下层（M/SM）以及肌层（ME）进行转录谱分析。该研究成果发表在《Molecular Medicine》杂志上，为理解结肠吻合口愈合和渗漏的机制提供了关键线索。

研究人员在研究中用到了多种关键技术方法。首先是构建小鼠的结肠吻合模型，采用 8 - 0 Vicryl 缝线进行近端结肠端端吻合。术后不同时间点处死小鼠，收集吻合口组织及对照组织。然后通过 3’ 批量 mRNA 测序技术，分析不同肠层组织的转录谱变化；运用免疫荧光染色技术，检测特定蛋白的表达情况；还利用组织学染色和胶原蛋白定量分析，评估吻合口组织的愈合情况。

研究结果如下：

1. 验证成功分离肠道层：通过比较 M/SM 和 ME 层特异性基因的表达，发现 M/SM 特异性基因 Muc₂和 Vil₁在 M/SM 层表达更高，而 ME 层特异性基因 Acta₂、Tuba₁a 和 Uchl₁在 ME 层表达更高，表明成功分离了这两层组织。
2. M/SM 和 ME 术后 6h 启动炎症和血管生成：术后 6h，M/SM 层与未手术的对照组相比，有 1037 个基因上调，617 个基因下调。基因集富集分析（GSEA）显示，炎症相关通路显著富集，同时血管生成相关通路也被激活，如 HIF₁α 和 FGF₂表达上调。ME 层在术后 6h 也呈现出类似的变化，且与 M/SM 层的转录谱存在正相关。
3. 术后 24h 增殖期开始：在 M/SM 层，24h 时与 6h 相比，有 633 个基因上调，684 个基因下调。GSEA 表明细胞增殖相关通路富集，同时免疫反应相关通路下调。ME 层在 24h 同样进入增殖期，但与 M/SM 层不同的是，其炎症相关通路显著上调。
4. 术后 72h 细胞外基质重塑开始：在 M/SM 层，72h 时与 24h 相比，有 136 个基因上调，132 个基因下调。GSEA 显示细胞外基质（ECM）重塑相关通路富集，且 MMPs 和胶原蛋白的表达呈现时间依赖性变化。ME 层在 72h 也出现 ECM 重塑相关通路的上调，同时 M/SM 层在 72h 还出现炎症和血管生成相关通路的再次富集，免疫荧光染色证实细胞浸润从以 Ly6G⁺中性粒细胞为主转变为以 IBA - 1⁺巨噬细胞为主。
5. M/SM 的转录特征可区分 CAL 和 CAH：在术后 72h，50% 的小鼠出现 CAL。主成分分析（PCA）显示，ME 层的 CAL 和 CAH 样本聚类在一起，无法区分；而 M/SM 层的 CAL 和 CAH 样本聚类分开，差异基因分析表明 CAL 组有 383 个基因上调，186 个基因下调。
6. CAL 中 ECM 重塑和伤口愈合通路下调：对 M/SM 层 CAL 和 CAH 样本进行基因本体（GO）分析，发现 CAL 组下调基因与 ECM 重塑、伤口愈合和细胞迁移等相关。通过与未手术的对照组比较，发现 CAL 组缺乏一些参与这些通路的关键基因，如 Col₁₈a₁、Col₁₆a₁、Pdpn 和 Timp₁等。蛋白质水平的验证也发现，CAL 组的胶原蛋白含量低于 CAH 组，IL - 34 在 CAL 组表达降低，而 Bambi 在 CAL 组表达升高。

研究结论和讨论部分指出，本研究详细描述了 CAH 和 CAL 过程中 M/SM 和 ME 层的转录变化。发现这两层在伤口愈合的炎症、增殖和重塑阶段大多同步，但也存在一些差异。M/SM 层的转录谱差异能够区分 CAL 和 CAH，且 CAL 的发生可能与 M/SM 层愈合过程中的异常有关，尤其是 ECM 重塑和伤口愈合相关基因的表达异常。这一研究为进一步探究 CAL 的发病机制提供了重要依据，所确定的相关基因可能成为潜在的生物标志物，有助于早期预测 CAL 的发生。同时，也为未来研究不同阶段吻合口炎症和愈合的基因调控提供了有价值的参考，为改善结肠吻合口愈合、降低 CAL 发生率的临床研究奠定了基础。