PepH3 修饰纳米载体：跨越血脑屏障递送疗法的新希望

《Fluids and Barriers of the CNS》：PepH3-modified nanocarriers for delivery of therapeutics across the blood-brain barrier

血脑屏障（BBB）限制药物进入大脑，影响脑部疾病治疗。研究人员开展 PepH3 修饰纳米载体跨越 BBB 递送治疗药物的研究，发现 PepH3 增强纳米颗粒摄取和单域抗体（sdAb）跨 BBB 转运。这为脑部疾病药物递送提供新策略，有望改善治疗效果。

　　在大脑的 “防御堡垒” 血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）面前，许多治疗脑部疾病的药物都 “望而却步”。像阿尔茨海默病、帕金森病等脑部疾病，严重威胁着人们的健康，给社会和家庭带来沉重负担。然而，研发的多数治疗神经系统疾病的候选药物，因 BBB 的阻碍，难以抵达大脑靶点发挥作用。免疫疗法，特别是针对淀粉样 β（Aβ）肽的单克隆抗体，虽为阿尔茨海默病治疗带来希望，但 BBB 穿透性差、免疫原性以及长期稳定性低等问题，使得这些疗法的疗效和安全性难以保障。

为突破这些困境，来自匈牙利生物研究中心、葡萄牙里斯本大学医学院等机构的研究人员，开展了一项极具意义的研究。他们致力于开发一种创新的纳米载体，将其与 PepH3（一种源自登革热病毒 2 型衣壳蛋白的阳离子肽）结合，试图让纳米载体成为跨越 BBB 的 “摆渡船”，搭载能识别 Aβ 寡聚体的单域抗体（single domain antibody，sdAb）进入大脑。

研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。细胞培养技术，他们分离培养了大鼠脑内皮细胞（RBEC）、周细胞（RPC）、星形胶质细胞（RAC）以及人脑血管内皮细胞（HBEC5i）。通过动态光散射（DLS）技术来测量纳米颗粒（NPs）的流体动力学尺寸、多分散指数（PDI）和表面电荷（zeta 电位），以此表征 NPs 的物理化学性质。使用共聚焦激光扫描显微镜观察细胞对 PepH3 肽和 NPs 的摄取情况以及 NPs 在细胞内的定位。采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术检测样本中的 sdAb 等。

下面来看看具体的研究结果。

1. 纳米载体的物理化学性质：非标记和 PepH3 标记的纳米载体，直径在 98 - 193nm 之间，PDI 值低于 0.32，表明尺寸分布良好。PepH3 的存在使纳米载体表面电荷更趋于正电，zeta 电位增加约 2mV。大分子量的 Texas Red 标记的牛血清白蛋白（TR - BSA）封装效率在非标记和 PepH3 标记的纳米载体中分别为 32% 和 24%，而较小的 sdAb 封装效率更高，分别为 93% 和 68%。
2. 纳米囊泡的结构稳定性：在不同 pH 和缓冲条件下，除了非标记纳米颗粒在 pH 5 的 PBS 中孵育 24h 后直径和 PDI 增加，表明稳定性降低外，其他纳米颗粒的特性在不同条件下变化不大，说明 PepH3 标记的纳米颗粒稳定性良好。
3. 纳米颗粒的蛋白质冠：在血清条件下，纳米颗粒会形成蛋白质冠。10min 时，未标记纳米颗粒尺寸增加 5.4 倍，PepH3 标记的纳米颗粒增加 2.5 倍，之后蛋白质冠在 24h 内变化不明显，且使纳米颗粒表面电荷更负。
4. PepH3 和纳米颗粒对脑内皮细胞活力的影响：通过实时阻抗测量和比色终点法分别检测，结果显示 PepH3 肽、标记和未标记的纳米颗粒在一定浓度范围内对 RBEC 和 HBEC - 5i 细胞活力无明显影响。
5. PepH3 肽的细胞内化：共聚焦显微镜观察发现，Quasar570 标记的 PepH3 肽在 RBEC 中孵育 30min 后即可见荧光信号，5h 和 24h 后细胞摄取量随时间增加，24h 时是 30min 时的 6 倍。
6. PepH3 标记和未标记纳米颗粒货物的细胞内化：在 RBEC 中，PepH3 标记的纳米颗粒中 TR - BSA 货物的细胞内化在各时间点均显著高于未标记组，24h 时 N - PepH3 组荧光强度是 N 组的 1.25 倍。
7. 纳米颗粒货物的细胞摄取机制：使用内吞作用抑制剂（filipin、cytochalasin D）和代谢抑制剂（sodium azide）处理细胞，以及在 4℃下培养，结果表明 PepH3 标记的纳米颗粒的细胞内化是能量依赖的，且部分通过内吞作用介导。同时，改变细胞表面电荷实验显示，细胞表面静电屏障显著影响阳离子 PepH3 标记纳米颗粒的摄取。
8. 纳米颗粒货物与内质网、高尔基体和溶酶体的共定位：共聚焦显微镜观察和图像分析表明，纳米颗粒货物与内质网（ER）共定位面积最大，其次是高尔基体，与溶酶体共定位较少，说明大部分货物可避免细胞降解。
9. PepH3 肽和 PepH3 标记纳米颗粒跨越大鼠和人血脑屏障模型的通透性：在大鼠 BBB 模型中，PepH3 肽的 P_app为 2.5×10^-6 cm/s，是跨细胞 BBB 标记分子白蛋白的 71 倍。在大鼠和人 BBB 模型中，PepH3 标记的纳米颗粒使 sdAb 货物的转运分别增加 6.1 倍和 6.4 倍。

综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。PepH3 肽作为纳米载体的标记配体，不仅增强了纳米颗粒荧光货物在脑内皮细胞中的摄取，还促进了 sdAb 作为潜在治疗分子跨越 BBB 的转胞吞作用。这一成果为脑部疾病，尤其是阿尔茨海默病的治疗提供了新的药物递送策略，有望改善现有治疗手段的局限性，提高治疗效果。虽然目前研究尚未提供体内数据，但体外实验结果为后续的体内研究奠定了坚实基础，未来有望进一步优化纳米载体的制备，实现大规模生产，推动脑部疾病治疗的新突破。