鼻内应用双功能百日咳黏附素 - RTX 融合抗原：为小鼠气道黏膜抵御百日咳杆菌定植带来新希望

《mSphere 3.7》：Intranasal application of a bifunctional pertactin-RTX fusion antigen elicits protection of mouse airway mucosa against Bordetella pertussis colonization

本文聚焦百日咳疫苗研究。目前无细胞百日咳（aP）疫苗虽广泛使用，但疫情仍时有爆发。研究构建 rPrn - RTX908 融合抗原，发现其能诱导产生多种抗体，增强小鼠气道免疫保护，对开发下一代 aP 疫苗意义重大，值得关注。

　　### 引言
百日咳是一种由百日咳杆菌（Bordetella pertussis）引发的高传染性呼吸道疾病。尽管全球百日咳疫苗接种率超 83%，但它仍是控制效果最差的疫苗可预防传染病。每年全球约有 2000 万百日咳病例，导致约 15 万婴儿死亡。自无细胞百日咳（aP）疫苗投入使用后，一些发达国家在 7 - 14 年内出现百日咳疫情反弹，且自 2023 年秋季起，欧盟和其他高收入国家的 aP 疫苗高接种人群中也出现大规模疫情。同时，aP 疫苗的使用还促使不产生百日咳黏附素（Prn）的百日咳杆菌突变株出现。因此，开发能限制病原体传播的下一代百日咳疫苗迫在眉睫。

百日咳杆菌的 RTX（repeats - in - toxin）家族腺苷酸环化酶毒素（CyaA）片段是极具潜力的疫苗抗原候选成分。CyaA 能特异性靶向表达毒素受体 CD11b 的吞噬细胞，抑制其对补体调理细菌的摄取和杀菌活性氧（ROS）的产生。CyaA 中和抗体可保护小鼠免受致命的百日咳杆菌感染，并加速清除感染肺部的细菌。基于对 RTX 结构的研究，可制备能诱导 CyaA 中和抗体的 RTX 片段。

在本研究中，研究人员构建了包含 Prn 乘客结构域的 rPrn 和 rsPrn 蛋白，并将 CyaA 来源的 RTX908 片段抗原与它们融合，生成能同时诱导抗 Prn 和抗 CyaA 功能性抗体的杂交抗原，探究其对小鼠气道感染的保护作用。

结果

1. Prn 与 RTX 片段融合后折叠更快且呈现天然百日咳黏附素的免疫显性表位
   从大肠杆菌包涵体中提取的重组 Prn 抗原折叠动力学缓慢。研究人员假设，与 Prn C 末端融合的 RTX 结构域在 Ca²⁺驱动下的快速折叠，可能促进 Prn 部分的折叠。从多个 RTX 结构域片段中，选择了 RTX908 作为与 Prn 融合的最佳片段。

研究人员构建了 rsPrn - RTX908 和 rPrn - RTX908 融合蛋白，并在大肠杆菌中表达、纯化。通过荧光光谱和圆二色谱分析发现，Prn - RTX908 融合蛋白在稀释到含钙缓冲液后能快速折叠，而未融合的 rsPrn 和 rPrn 蛋白折叠缓慢。利用识别 Prn 构象和线性表位的单克隆抗体进行抑制 ELISA 实验，结果显示 rPrn - RTX908 融合蛋白能更好地呈现 Prn 的免疫显性区域 1 和区域 2 的表位，尤其是构象表位。
2. rPrn - RTX908 融合抗原诱导的调理和 CyaA 中和抗体，使暴露于 CyaA 毒素的中性粒细胞能够进行氧化爆发和调理吞噬摄取百日咳杆菌
Prn 是百日咳杆菌的主要保护性抗原，抗 Prn 抗体水平与对百日咳疾病的保护作用相关。研究人员通过腹腔免疫小鼠，比较了 rsPrn、rPrn 及其与 RTX908 融合蛋白的免疫原性。结果显示，所有重组蛋白都能诱导高水平的 Prn 特异性抗体，且 rsPrn - RTX908 和 rPrn - RTX908 融合蛋白能诱导产生高水平的 RTX 特异性抗体，这些抗体能有效阻断 CyaA 与 THP - 1 细胞的结合。

进一步实验表明，只有含有抗 Prn 调理抗体和 CyaA 中和抗体的双特异性血清，才能在存在 30 ng/mL CyaA 的情况下，使 dHL - 60 细胞高效摄取调理后的百日咳杆菌。同时，rPrn - RTX908 融合抗原诱导的抗体能解除 CyaA 对 dHL - 60 细胞氧化爆发的抑制作用。
3. 同时诱导抗 Prn 和 CyaA 中和抗体可增强小鼠肺部对百日咳杆菌感染的保护
研究人员通过小鼠肺部清除模型，评估了 Prn - RTX908 融合抗原诱导的免疫保护作用。结果显示，腹腔免疫 Prn 蛋白变体或其 Prn - RTX908 融合蛋白，都能使小鼠肺部对百日咳杆菌感染产生高水平的保护。其中，rPrn - RTX908 融合蛋白能使感染小鼠肺部的细菌数量在 7 天内快速下降，表明 CyaA 中和抗体与抗 Prn 调理抗体的协同作用，能更有效地清除感染小鼠肺部的百日咳杆菌。
4. 鼻内免疫 rPrn - RTX908 抗原在肺部引发卓越的保护性免疫，并显著限制百日咳杆菌在鼻腔黏膜的定植
腹腔注射的 IgG 诱导型铝佐剂蛋白疫苗无法有效保护小鼠鼻腔黏膜免受百日咳杆菌感染。研究人员将 rPrn - RTX908 抗原等加入许可的铝佐剂儿科 Hexacima 疫苗（D - T - aP - Hib - HepB - IPV）中，进行鼻内免疫实验。

结果显示，鼻内免疫 rPrn - RTX908 融合抗原能诱导产生针对 rPrn 和 RTX908 的特异性血清 IgG 和唾液分泌型 sIgA 反应。与单独使用 Hexacima 疫苗相比，鼻内免疫含 rPrn - RTX908 融合抗原的疫苗，能使小鼠在感染后第 1 天就有效控制肺部感染，且能显著降低鼻腔黏膜的细菌定植，在感染后第 7 天，鼻腔内细菌载量明显低于其他组。

讨论

本研究表明，Prn 抗原性乘客结构域与 CyaA 毒素的 RTX 片段融合，能加速 Prn 的折叠，且融合抗原能诱导功能更优的抗体反应。rPrn - RTX908 融合抗原在与 PT 和 FHA 疫苗混合鼻内应用时，能显著增强小鼠肺部对百日咳杆菌感染的保护，且首次证明其能有效保护鼻腔黏膜免受细菌定植。

对于为何腹腔免疫时，游离的 rPrn 和 rsPrn 蛋白诱导的抗 Prn 血清 IgG 反应高于 rPrn - RTX908 和 rsPrn - RTX908 抗原，而鼻内给药时情况相反，研究人员推测可能与抗原稳定性、抗原呈递等因素有关。此外，rPrn - RTX908 融合蛋白诱导的 sIgA 抗体与血清 IgG 反应之间存在功能协同作用，有助于更有效地清除感染。

本研究证实了能诱导毒素中和抗体的 CyaA 衍生抗原，是下一代 aP 疫苗的有前景的候选成分。未来，需要开发不含铝的黏膜疫苗配方，以进一步提高 rPrn - RTX908 疫苗抗原的免疫原性。

材料和方法

1. 细菌菌株和质粒构建：通过 PCR 扩增百日咳杆菌 Tohama I 的 prn 基因片段，构建表达 rsPrn、rPrn、rPrn - RTX908 和 rsPrn - RTX908 蛋白的质粒，并进行测序验证。
2. 重组抗原：在大肠杆菌中表达 RTX908、rsPrn - RTX908、rPrn - RTX908、rsPrn 和 rPrn 蛋白，经包涵体提取、纯化、去除内毒素等步骤获得高纯度蛋白，部分实验前进行折叠处理，并测定蛋白浓度和内毒素含量。
3. 天然百日咳黏附素的制备：从百日咳杆菌突变株中纯化天然百日咳黏附素，经离子交换色谱等步骤去除杂质和脂寡糖（LOS）。
4. 蛋白质印迹：使用特异性抗体通过蛋白质印迹法确认蛋白身份。
5. 蛋白质折叠评估：分别通过荧光光谱和圆二色谱监测蛋白质折叠动力学。
6. 百日咳杆菌菌株和生长条件：培养百日咳杆菌 Tohama I 及其 Str^R突变株，用于小鼠感染实验。
7. 动物免疫和感染：通过腹腔注射或鼻内接种的方式免疫小鼠，用百日咳杆菌感染小鼠，收集血清、唾液等样本，测定抗体水平和细菌载量。
8. 抗体定量和亲和力评估：采用 ELISA 法测定血清和唾液中的抗体浓度，并评估抗体亲和力。
9. 表位呈现评估：通过抑制 ELISA 评估蛋白质的相对抗原性。
10. CyaA 中和测定：检测小鼠血清对 CyaA 与 THP - 1 细胞结合的抑制作用，评估 CyaA 中和活性。
11. 调理吞噬摄取测定：利用分化的 HL - 60 细胞和表达 mScarlet 的百日咳杆菌，通过流式细胞术测定调理吞噬摄取效率。
12. ROS 产生测定：使用负载 luminol 的 dHL - 60 细胞，测定 ROS 产生情况。
13. 统计分析：使用 Microsoft Excel 和 GraphPad Prism 10 软件进行统计分析。