基于 Cap 蛋白的猪圆环病毒 2 型抗体阻断 ELISA 检测方法的开发与应用：助力猪群健康监测

《Microbiology Spectrum 3.7》：Development and application of a blocking ELISA method based on Cap protein for detecting antibodies against porcine circovirus 2

《Development and application of a blocking ELISA method based on Cap protein for detecting antibodies against porcine circovirus 2》一文，开发了一种基于 Cap 蛋白的猪圆环病毒 2 型（PCV2）抗体阻断 ELISA 检测方法。该方法灵敏度达 94.7%、特异性 96.1% ，与商业试剂盒符合率 98.76%，为 PCV2 血清学监测和疫苗评估提供了有效工具。

　　

引言

猪圆环病毒 2 型（PCV2）自 1998 年被发现后，成为危害全球养猪业的重要病原体。它能引发多种疾病，如断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）等。PCV2 属于圆环病毒科圆环病毒属，是最小的 DNA 病毒，基因组为单链非包膜环状，有 9 种基因型，其中 PCV2b 曾广泛分布，PCV2d 是当前全球流行的优势毒株。其 ORF2 编码的 Cap 蛋白是主要结构蛋白，能引发免疫反应，是诊断和疫苗研发的关键靶点。

目前检测 PCV2 抗体的方法多样，免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）和间接免疫荧光试验（IFA）技术要求高、耗时久。酶联免疫吸附试验（ELISA）因操作简便、快速、成本低而被广泛应用，包括间接 ELISA、竞争 ELISA 等多种类型。但现有检测 PCV2 抗体的商业试剂盒多采用间接 ELISA，易出现假阳性，因此开发更高效的检测方法迫在眉睫。本研究利用重组 Cap 蛋白和单克隆抗体（mAb）3G5 建立了阻断 ELISA 方法，用于 PCV2 抗体检测。

结果

1. PCV2d 进化树分析及重组病毒 rPCV2d 的拯救：对 PCV2d 全基因组序列进行进化树分析，确定分离病毒属于 2d 亚型。将纯化的重组质粒 pSK-PCV2d 转染 PK-15 细胞，经过 16 代传代培养，获得重组病毒 rPCV2d。PCR 和 Western blot 实验证实了病毒的成功拯救，且经多代传代后基因组稳定，病毒滴度为 10^5.5 TCID₅₀/mL，满足实验要求。
2. 抗 PCV2 Cap 单克隆抗体的制备与纯化：通过传统方法制备单克隆抗体，经多轮筛选和亚克隆获得杂交瘤细胞系 mAb 3G5。利用蛋白 A 重力流柱试剂盒纯化小鼠腹水得到 mAb 3G5，SDS-PAGE 实验显示其重链和轻链分别在 50kDa 和 25kDa 处有清晰条带。ELISA 实验表明 mAb 3G5 与 Cap 蛋白有亲和力，Western blot 和 IFA 实验进一步证实其能特异性识别 PCV2 感染的 PK-15 细胞中的 Cap 蛋白。
3. 基于 PCV2 Cap 蛋白和 mAb 3G5 的阻断 ELISA 方法的建立：采用棋盘滴定法确定了 Cap 蛋白的最佳包被浓度为 0.1μg/mL，mAb 3G5-HRP 的最佳稀释度为 1:2000，血清最佳稀释度为 1:2。通过检测 51 份 PCV2 阴性血清和 395 份阳性血清，计算抑制率（PI），确定 PI 临界值为 33.8% 时，该方法诊断特异性为 96.1%，敏感性为 94.7%，受试者工作特征曲线（ROC）分析显示曲线下面积（AUC）为 0.990，表明准确性高。
4. 阻断 ELISA 的敏感性和特异性：对 11 份 PCV2 阳性血清进行 2 倍系列稀释检测，结果显示在 1:128 稀释度时，所有样本 PI 均超过 33.8%，部分样本稀释至 1:256 仍可检测到，表明该方法敏感性良好。检测多种猪病毒阳性血清发现，只有 PCV2 抗血清呈阳性，其他如非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）等血清均为阴性，说明该方法特异性高。
5. 阻断 ELISA 的重复性和再现性：对 7 份 PCV2 阳性血清和 4 份阴性血清进行检测，计算批内和批间变异系数（CV）。批内 CV 范围为 0.2% - 9.3%，批间 CV 范围为 0.1% - 9.2%，均低于 10%，表明该方法重复性和再现性良好。
6. 阻断 ELISA 与商业间接 ELISA 试剂盒的比较：用建立的阻断 ELISA 和商业间接 ELISA 试剂盒检测 402 份猪血清样本，商业试剂盒阳性率为 94.78%，阻断 ELISA 阳性率为 93.53%，二者符合率为 98.76%，kappa 值为 0.888，表明两种方法一致性强。

讨论

PCV2 对养猪业经济影响巨大，它主要侵害猪的免疫系统，导致淋巴细胞减少和免疫抑制。单独感染 PCV2 的仔猪症状较轻，但与其他病原体共感染时会加重病情，如猪流感病毒、猪细小病毒等。此外，免疫刺激、疫苗失败和应激等因素也会加剧疾病发展。目前市场上的 PCV2 疫苗多针对单一基因型，而 PCV2 进化快，新基因型不断出现，给疫苗研发带来挑战，因此监测猪群 PCV2 抗体水平对制定免疫计划和评估疫苗效果至关重要。

常用的 PCV2 抗体检测方法各有优缺点，ELISA 应用广泛。本研究建立的基于 Cap 蛋白和 mAb 3G5 的阻断 ELISA 方法，相比之前的方法，具有更高的敏感性和特异性，且操作时间更短。实验发现真核表达的 Cap 蛋白作为包被抗原效果更好，mAb 3G5 能与 PCV2b 和 rPCV2d 基因型结合，可用于评估针对这些毒株的抗体水平。与商业间接 ELISA 试剂盒对比显示，该阻断 ELISA 方法可靠性高，可作为监测 PCV2 疫苗效果的有效工具。

综上所述，本研究建立的阻断 ELISA 方法是检测血清中 PCV2 抗体水平的有效手段，与其他病毒血清无交叉反应，与商业试剂盒一致性高，有望成为高效、标准化的 PCV2 血清学检测方法，为疫苗接种策略制定和猪群管理提供有力支持。

材料和方法

1. 病毒和细胞：PCV2b 由江苏省农业科学院动物免疫工程研究所提供，PK-15 细胞在含 10% 新生牛血清、100U/mL 青霉素和 100μg/mL 链霉素的 MEM 培养基中，于 37°C、5% CO₂环境下培养。PCV2 Cap 蛋白由上海兽医研究所陈龙博士提供，通过杆状病毒表达系统制备。
2. PCV2d 进化树分析：利用 Mega 软件对实验室保存的 PCV2d 病毒全基因组进行分析。
3. 重组病毒 PCV2d 的拯救：由于实验室保存的 PCV2d 病毒滴度低，合成含完整基因组序列的质粒 pLB-PCV2d，经 EcoR I 酶切、连接、克隆等步骤构建重组质粒 pSK-PCV2d，转染 PK-15 细胞，经过多次传代获得重组病毒 rPCV2d。
4. 抗 PCV2d Cap 蛋白单克隆抗体的制备：用拯救的 rPCV2d 病毒皮下免疫 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠，共免疫 4 次，每次间隔 14 天。最后一次免疫 3 天后，取脾脏细胞与 SP2/0 细胞融合，经筛选和亚克隆获得 mAb 3G5，纯化后标记 HRP 用于阻断 ELISA 检测。
5. SDS-PAGE 分析：将纯化的 mAb 3G5 与 5× loading buffer 混合，100°C 变性 10 分钟，进行 12.5% SDS-PAGE 凝胶电泳，染色后观察条带。
6. Western blot：用 PCV2b 和 rPCV2d 感染 PK-15 细胞，收集细胞裂解液制备样本，经 SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜、封闭后，依次与 mAb 3G5 和 HRP 标记的二抗孵育，用 ECL 试剂盒检测。
7. IFA：将 PCV2b 和 rPCV2d 感染 PK-15 细胞，固定、通透、封闭后，与 mAb 3G5 孵育，再与 Alexa Flour 488 标记的二抗孵育，在荧光显微镜下观察。
8. 阻断 ELISA 的建立：采用棋盘滴定法确定 Cap 蛋白包被浓度、mAb 3G5 工作浓度，通过检测阳性和阴性参考猪血清，计算 PI 值确定最佳实验条件。
9. 阻断 ELISA 的特异性和敏感性分析：检测多种猪病毒阳性血清评估特异性，对 PCV2 阳性血清进行系列稀释检测评估敏感性。
10. 阻断 ELISA 的重复性和再现性评估：通过计算批内和批间 CV 评估重复性和再现性。
11. 阻断 ELISA 与商业 ELISA 试剂盒的比较：用两种方法检测 402 份临床血清样本，用 SPSS 软件分析结果，计算 kappa 值评估一致性。