传统中药配方 CCM 在 2 型糖尿病治疗中，于调节肠道菌群方面较二甲双胍更具优势的研究及意义

《Microbiology Spectrum 3.7》：Gut microbiota’s role in the enhancement of type 2 diabetes treatment by a traditional Chinese herbal formula compared to metformin

本文聚焦 2 型糖尿病（T2DM），对比传统中药配方 CCM 与二甲双胍的疗效。研究发现，CCM 在改善 T2DM 小鼠血糖、血脂、体重等指标上优于二甲双胍，且能显著改变肠道菌群结构和功能，为 T2DM 治疗提供新策略。

　　

研究背景

2 型糖尿病（T2DM）是一种全球范围内快速增长的代谢性疾病，对公共健康构成重大威胁。它主要由胰岛素抵抗引起，与高热量饮食等不良生活习惯密切相关。近年来，随着宏基因组学的发展，肠道菌群在 T2DM 病理生理学中的关键作用逐渐被揭示。例如，T2DM 患者存在肠道微生物群失调，产丁酸细菌显著减少 。同时，临床研究表明，通过饮食干预调节肠道菌群，如增加膳食纤维摄入，可缓解 T2DM 症状。此外，多种调节肠道菌群的策略，包括饮食、益生元、益生菌和药物等，都在探索用于 T2DM 的管理。

二甲双胍作为 T2DM 的一线治疗药物，能够调节肠道菌群，增加 Akkermansia muciniphila 的丰度，减少 Intestinibacter 的存在，改善代谢结果。传统中药（TCM）在中国长期用于治疗代谢性疾病，研究显示，传统中药可通过改变肠道菌群治疗 T2DM。如 “黄连解毒汤” 能增加有益的 Akkermansia 细菌水平，减少有害的 Firmicutes，降低胰岛素抵抗；“天芪胶囊” 可增强有益肠道细菌 Bacteroidetes 的多样性，减少具有炎症特性的 Proteobacteria，调节血糖水平。

本研究使用的 CCM 是一种基于厥阴理论、已获专利的新型中药配方，由黄连（Coptis rhizoma）、肉桂（Cinnamomi cortex）和乌梅（Mume fructus）组成，通过调节肝脾发挥治疗糖尿病的作用。尽管临床实践已证明 CCM 治疗 T2DM 的有效性，但具体分子机制，尤其是肠道菌群的作用尚不清楚。因此，本研究以正常 C57 小鼠为健康对照，二甲双胍为阳性对照，用不同浓度的 CCM 处理糖尿病 C57/db/db 小鼠 4 周，探究肠道菌群与 CCM 治疗 T2DM 临床指标改善之间的关系。

研究方法

1. 药物和动物模型：CCM 草药配方中的草药购自中国河北省神农草药切片有限公司，制成免煮颗粒。二甲双胍购自中国上海源叶生物技术公司。实验使用 8 周龄的 C57BL/KsJ (BKS) db/db 糖尿病小鼠和正常 C57BL/Ks 小鼠，由北京维通利华公司提供。
2. 研究设计和动物实验：将 50 只 8 周龄雄性 db/db 小鼠和 13 只健康雄性 C57BL/Ks 小鼠在标准实验室条件下饲养，环境温度 22±2°C，相对湿度 40 - 60%，12 小时光照 / 黑暗周期。适应 1 周后，db/db 小鼠随机分为四组：低剂量 CCM 组（2.3 g/kg/ 天）、中剂量 CCM 组（4.6 g/kg/ 天）、高剂量 CCM 组（9.2 g/kg/ 天）和二甲双胍组（0.3 g/kg/ 天），通过口服灌胃给药，持续 4 周。另设 T2DM 组（13 只 db/db 小鼠），不接受任何药物治疗。实验期间监测小鼠体重。
3. 血液 / 血清生化分析：从小鼠尾静脉采集血液样本，储存于 - 80°C。使用拜耳 Contour TS 血糖仪测量空腹血糖（FBG）水平。采用自动生化分析仪，按照制造商的指南测定血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL - C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL - C）、血尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）的水平。
4. 口服葡萄糖耐量试验：实验前小鼠禁食 12 小时，测量尾静脉血样的基线葡萄糖水平。口服给予 2 g/kg 体重的葡萄糖溶液后，在 30、60 和 120 分钟时采集尾静脉血样，用血糖仪测量葡萄糖水平，并绘制葡萄糖测量值随时间的变化曲线，计算曲线下面积（AUC）。
5. 组织病理学观察：将肝组织切片固定在 4% 多聚甲醛中 24 小时，经梯度乙醇脱水、二甲苯浸润后，石蜡包埋，制成 5μm 厚的切片，用苏木精和伊红染色，通过连接在徕卡显微镜上的数码相机系统拍摄组织学图像。
6. 粪便 DNA 提取：收集小鼠粪便样本，储存于 - 80°C。使用 QIAmp DNA Stool Mini Kit 提取基因组 DNA，通过 1% 琼脂糖凝胶电泳确认提取 DNA 的质量。
7. V4 16S rRNA 基因区域扩增和测序：以提取的基因组 DNA 为模板，扩增 16S rRNA 基因的 V4 区域。PCR 反应、PCR 扩增子测序和原始数据质量控制按照先前描述的方法进行。测序在 Illumina HiSeq 2500 平台上进行，产生 250 bp 的双端读数，使用 FLASH 软件合并双端读数。16S rRNA 基因扩增子读数的高通量测序数据（原始数据）已存入国家基因组数据中心（GSA 登录号：CRA011391）。使用 QIIME2 version 2020.2 根据特定标准过滤原始读数，获取高质量读数。
8. 测序数据分析：使用 VSEARCH version 2.0.3 进行序列分析，将相似度达到 97% 或更高的序列生成操作分类单元（OTU）。选择每个 OTU 的代表性序列进行进一步注释，基于 Silva_16s_v123 对 OTU 进行分类学分类。将 OTU 丰度数据标准化为样本中序列数最少的样本的标准序列计数。使用 QIIME2 进行 α - 和 β - 多样性分析，计算 Richness 和 Shannon 指数评估群落丰富度和多样性，通过生成主坐标分析（PCoA）图，使用 Jaccard 距离分析 β - 多样性。
9. 统计分析：使用 R 包 ggpubr 对不同组的临床参数进行多变量分析，评估统计显著性。使用 edgeR、STAMP 和线性判别分析效应大小分析（LEfSe）三种独立方法对组间 OTU 进行差异分析。基于每个组中 OTU 的相对丰度，使用 R 包 ggClusterNet 中的 cluster_fast_greedy 方法构建微生物群网络，根据 OTU 的模块内连通性（Zi）和模块间连通性（Pi）分析其在网络中的拓扑作用。基于稳健相关性，使用强 Spearman 相关系数（|r| > 0.8）和 P 值小于 0.05 为所有差异 OTU 构建网络，探索不同组中 OTU 的功能共存情况。使用 PICRUSt2 基于 16S rDNA 序列预测微生物群落的功能能力，根据京都基因与基因组百科全书（KEGG）和 MetaCYC 数据库对代谢途径进行注释。应用适用于微生物组数据的线性多变量回归模型（MaAsLin，Multivariate microbial Association by Linear models）识别微生物与表型变量之间的显著关联，相关代码可在 GitHub 上获取。

研究结果

1. 高、中剂量 CCM 对 T2DM 小鼠高血糖和高血脂的治疗效果优于二甲双胍：在 4 周的实验期间，监测 CCM 和二甲双胍对小鼠体重和血糖代谢的影响。结果显示，CCM 治疗，尤其是中、高剂量组，在疗效上优于二甲双胍。CCM 处理的小鼠体重保持稳定，而二甲双胍组小鼠体重显著增加（P = 0.0032）。在血糖控制方面，中、高剂量 CCM 组的空腹血糖（FBG）水平显著降低（中剂量组，P = 0.0024；高剂量组，P = 0.022），而二甲双胍组无明显变化。此外，中、高剂量 CCM 组在口服葡萄糖耐量试验（OGTT）中表现出更好的葡萄糖清除能力，峰值葡萄糖水平更低，曲线下面积（AUC）值更小。

在血清脂质谱方面，治疗 4 周后，二甲双胍和 CCM 组均显著降低血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL - C）水平（P < 0.0001），所有治疗组的高密度脂蛋白胆固醇（HDL - C）水平均显著增加（二甲双胍组 P = 0.003，低剂量 CCM 组 P = 0.019，中、高剂量组 P < 0.0001），甘油三酯（TG）水平在所有组中保持不变，中、高剂量 CCM 组总胆固醇（T - CHOL）水平有所增加，可能是由于血清 HDL - C 水平升高所致。同时，中、高剂量 CCM 组在调节脂质谱方面比二甲双胍组更有效。

通过对肝组织切片进行苏木精 - 伊红（HE）染色观察发现，CCM 化合物有效改善了糖尿病小鼠肝脏的脂肪积累和脂肪变性。正常小鼠肝脏肝细胞排列有序，无明显脂肪积累；糖尿病小鼠肝脏出现脂肪变性，肝细胞中有明显脂肪滴，形态呈空泡状；二甲双胍治疗后，肝细胞形态总体趋于正常，无明显脂肪变性；低剂量 CCM 治疗后，虽仍有一些脂肪滴，但脂肪变性总体减少；高剂量 CCM 治疗后，糖尿病小鼠肝脏脂肪滴数量显著减少，肝细胞形态更接近正常，改善效果最为显著。

在监测肝脏和肾脏相关参数时，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和肌酐（CREA）水平无明显变化，而血尿素氮（BUN）水平在治疗后持续下降（P < 0.05），表明二甲双胍和 CCM 均未对肝脏和肾脏功能产生不良影响。2. CCM 草药配方对 T2DM 小鼠肠道菌群结构及其相互作用的影响比二甲双胍更强：对 T2DM 小鼠的粪便样本进行 16S rRNA 基因测序，分析二甲双胍和 CCM 草药配方处理后肠道菌群的结构变化，以正常 C57 小鼠为健康对照。共获得来自 87 个样本的 16,555,731 条原始序列（16,202 unique 序列），平均每个样本有 190,296 条读数。

α - 多样性分析显示，CCM 处理组的微生物多样性显著降低（P < 0.001），而二甲双胍处理组的微生物多样性增加。β - 多样性评估（使用主坐标分析（PCoA）和 Jaccard 距离）表明，治疗后肠道菌群结构发生显著变化，CCM 的影响比二甲双胍更显著。此外，根据剂量变化，CCM 干预样本明显分为两组，即低、中剂量组（Low - wk4，Mid - wk4）和高剂量组（High - wk4）。

在门水平上，肠道菌群主要由 Firmicutes 和 Bacteroidetes 组成。治疗后，Firmicutes/Bacteroidetes 比值显著降低（P < 0.01），CCM 组，尤其是中、高剂量组的降低更为明显，且 CCM 处理组中 Verrucomicrobia 门的丰度比二甲双胍处理组有显著更大的增加。在属水平上，共鉴定出 124 个属，其中 14 个占主导地位（丰度高于 2%）。CCM 草药配方对 T2DM 小鼠肠道菌群组成的影响比二甲双胍更显著，特别是 Akkermansia、Bacteroides 和 Parabacteroides 等属在 CCM 处理组中显著增加。

使用线性判别分析效应大小分析（LEfSe）确定治疗组之间的属差异，结果显示，无论剂量如何，CCM 处理组均显著富集 Bacteroides、Parabacteroides、Blautia、Raoutaella、Klebsiella、Parasutterella、Robinsoniella 和 Akkermansia 等属。二甲双胍组也富集了一些与 CCM 组相同的属，包括 Bacteroides、Parabacteroides、Parasutterella 和 Akkermansia，且二甲双胍组中 Bifidobacterium 特别丰富。多组比较显示，健康对照组中 Bifidobacterium、Ruminiclostridium、Bacteroidales 和 Allobaculum 的丰度显著较高，而 T2DM 组中 Odoribacter、Rikenella、Lactobacillus、Peptococaceae 和 Roseburia 更为普遍。

为了解药物治疗对微生物相互作用的全球变化，构建了基于每个组中所有操作分类单元（OTU）的共丰度网络。结果发现，治疗后肠道细菌网络的模块性增加，CCM 处理组更为明显，其网络参数（如平均路径长度、直径和中心性指标（介数和接近度））增强。进一步将 OTU 节点的拓扑作用分为四类：外围节点、连接节点、模块枢纽和网络枢纽，发现模块枢纽和连接节点主要与 Ruminococcaceae、Lachnospiraceae 和 Bacteroidales_S24 - 7 组等科相关，且治疗后连接节点数量显著减少，尤其是在 CCM 干预后，这表明 CCM 治疗比二甲双胍更深刻地改变了肠道菌群的相互连接和结构，可能影响 T2DM 小鼠肠道微生物的整体功能和动态。3. CCM 和二甲双胍通过激活不同的 OTU 及其相关微生物模块对 T2DM 临床指标产生不同影响：通过 edgeR、STAMP 和 LEfSe 对 T2DM 组和治疗组（MET/Low/Mid/High - wk4）进行差异 OTU 分析，合并结果后确定了 613 个差异 OTU，占总丰度的 95% 以上。随后使用 MaAsLin2 分析发现，48 个关键 OTU 与至少一个 T2DM 临床参数显著相关。

其中，7 个 OTU 与 FBG 水平呈负相关，包括 Bacteroides（n = 3）、Bacteroidales_S24 - 7 组（n = 2）、Parabacteroide（n = 1）和 Gastranaerophilales（n = 1）的菌株；6 个 OTU 与 LDL - C 降低相关，包括 Bacteroidales_S24 - 7 组（n = 1）、Alistipes（n = 2）、Lachospiraceae_NK4A136（n = 1）、Ruminiclostridium_9（n = 1）和 Akkermansia（n = 1）；2 个 OTU 与体重减轻相关，包括 Bacteroidales_S24 - 7 组（n = 1）和 Lachospiraceae（n = 1）；3 个 OTU 与 BUN 水平呈负相关，包括 Parasutterella（n = 1）、Lachnoclostridium（n = 1）和 Bacteroidales_S24 - 7 组（n = 1）。

在评估药物治疗对 OTU 和临床特征的影响时，发现二甲双胍处理组中激活的 OTU 主要与血脂谱的改变相关，而 CCM 处理组中激活的微生物群落与糖尿病小鼠血糖和血脂参数的改善均显著相关。例如，Bacteroides 属的特定 OTU（OTU 1895、OTU 2548 和 OTU 3125）和 Parabacteroides 的 OTU 1903 与 FBG 水平降低显著相关，Akkermansia 属的 OTU 1484 与 LDL - C 水平降低显著相关。

网络模块可以反映参与代谢过程（如共营养）的密切相关物种。基于 613 个 OTU 构建具有高模块性的共丰度网络，这些 OTU 根据强 Spearman 相关性（R > 0.8）聚集成 14 个模块。CCM 和二甲双胍处理组中上调和下调的模块明显不同，表明它们对 T2DM 小鼠肠道菌群结构的影响和作用机制不同。CCM 处理后，模块 1 和模块 4 显著增加。模块 1 主要由 Bacteroidia（n = 17）和 Gammaproteobacteria（n = 3）的物种组成，在高剂量 CCM 组中特别丰富；模块 4 是最多样化的模块，包含 12 个不同的属（如 Alistipes、Bacteroides、Parabacteroides 和 Blautia），在所有 CCM 处理组中均显著增加。模块 4 中有 5 个 OTU 与 T2DM 临床参数显著相关，表明它可能是 CCM 干预组中的关键功能模块。二甲双胍处理后，模块 7、13、5 和 11 显著增加，但这些模块中只有 2 个 OTU（分别来自 Bacteroides 和 Lachnospiracea_UCG_001，OTU1626 和 OTU2811）与临床指标（LDL - C 和 HDL - C）显著相关。虽然二甲双胍诱导的微生物模块与 CCM 组不同，但两组抑制的模块相似，主要涉及 T2DM 组中显著增加的 5 个模块（8、12、2、3 和 10），且 CCM 组中这些模块的下降幅度更大，表明 CCM 组对 T2DM 小鼠肠道菌群结构的重塑和重建更为显著，可能提供独特的治疗机制。4. 与二甲双胍组相比，CCM 处理的 T2DM 小鼠中代谢途径的激活增强：使用 PICRUSt2 基于 16S rRNA 基因序列预测肠道菌群的功能，根据 KEGG 和 MetaCYC 数据库分别鉴定出 147 和 365 条微生物代谢途径。使用 MaAsLin2 分析这些途径与 T2DM 临床参数的显著关联，确定了 71 条与至少一个临床参数相关（P < 0.05）的关键途径。

其中，4 条细菌代谢<