一株丝状粒子新型类烟草花叶病毒在植物细胞中的复制及其进化意义

《Journal of Virology 4.0》：A novel tobamo-like mycovirus with filamentous particles replicates in plant cells

本文聚焦新型类烟草花叶病毒（NaTLV1），从致病真菌中分离鉴定，发现其能在烟草本氏烟（Nicotiana benthamiana）中复制，虽未观察到细胞间移动但不能排除。该研究对揭示类烟草花叶病毒及相关病毒起源进化意义重大，值得关注。

　　### 引言
植物和真菌间寄生与共生关系已存续数百万年，二者常受多种病毒感染。大量宏基因组研究表明，部分病毒科成员可在植物和真菌界传播，如Endornaviridae、Totiviridae等科病毒。Virgaviridae科部分成员也可能从植物传播至真菌。

Virgaviridae科依据基因组结构等特征分为 7 个属，其中Tobamovirus属病毒的（+）单链 RNA（ssRNA）基因组为单分体。2016 年首次报道类烟草花叶病毒全基因组，此后至少 10 种该类病毒被记录于 GenBank。它们一般含 9kb - 13kb 的（+）ssRNA 基因组、短 poly（A）尾及 3 - 4 个开放阅读框（ORF），但该类病毒能否形成典型病毒粒子、在植物中的感染性和毒力等研究有限。

丝状病毒粒子是许多（+）ssRNA 植物病毒科及部分真菌病毒的特征。Nigrospora aurantiaca是重要子囊菌属真菌，能产生红色素和多种次生代谢物，也是经济作物病原菌。本研究从该真菌中鉴定出新型类烟草花叶病毒 NaTLV1，对其进行多方面研究，为病毒进化提供新见解。

结果

1. NaTLV1 全基因组测序与分析：从N. aurantiaca菌株 A4 菌丝提取物中分离出约 10K 的单一双链 RNA（dsRNA）片段，经测序和组装，得到 NaTLV1 基因组。其全长 10,224nt（不含 poly（A）尾），GC 含量 51.7%，含 4 个部分重叠的 ORF，已提交 GenBank。
   • ORF1 编码病毒甲基转移酶（Mtr）和病毒 RNA 解旋酶（Hel）超家族蛋白，ORF2 编码 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp）结构域，二者与内源性Eutypa lata类烟草花叶病毒的假定复制酶通读蛋白相似性最高，但氨基酸序列同一性仅 37.38% 和 52.58%。NaTLV1 的 ORF1 和 ORF2 可能通过 UAG 终止密码子通读机制翻译产生融合蛋白。
   • ORF3 编码含 DEAD 样解旋酶超家族（DEXDc）结构域的假定运动蛋白（MP），与Acidomyces richmondensis类烟草花叶病毒 1 的假定 MP 相似性最高。
   • ORF4 编码假定衣壳蛋白（CP），与Mycosphaerella烟草花叶病毒 B 的假定 CP 相似性最高。
   
   
2. NaTLV1 的系统发育分析和基因组特征：基于 RdRp 核苷酸序列构建的系统发育树显示，NaTLV1 与其他类烟草花叶病毒聚在同一分支，在Virgaviridae科内形成独特分支，表明类烟草花叶病毒可能代表一个与Virgaviridae科密切相关的新属或新科。
   • NaTLV1 及相关类烟草花叶病毒的假定 MP 与Virgaviridae科其他属的 MP 差异显著，其氨基酸序列更长，且与Gammaflexiviridae科Entoleuca gammaflexivirus 1 的 MP 和Potyviridae科日本山药花叶病毒的柱状内含蛋白（CI 蛋白）相似，同源区域含 DEXDc 结构域。
   • 基于 CP 构建的系统发育树表明，NaTLV1 与部分类烟草花叶病毒聚在一起，靠近Gammaflexiviridae和Betaflexiviridae科成员，推测其衣壳形态更接近这两个科的病毒。
   
   
3. NaTLV1 的传播及其对宿主真菌的影响：NaTLV1 可通过真菌分生孢子垂直传播，传播率约 50%，也可在营养亲和的真菌菌株间通过菌丝融合水平传播。
   • NaTLV1 感染对N. aurantiaca的菌落形态、大小、产孢量及在N. benthamiana叶片上的毒力均无显著影响。
   
   
4. 与 NaTLV1 相关的病毒样粒子：通过蔗糖密度梯度超速离心纯化 NaTLV1 病毒粒子，在 20% 蔗糖组分（第 3 组分）的沉淀中检测到 NaTLV1 的 RT - PCR 片段和分子量约 37.0kDa 的 p37 蛋白，经肽质量指纹分析，p37 极可能是 NaTLV1 的 CP。透射电镜观察发现第 3 组分沉淀中有宽约 37nm、长约 1,100nm 的丝状病毒样粒子，而 NaTLV1 阴性菌株无此粒子，表明 NaTLV1 由 CP 包裹形成丝状病毒粒子。
5. NaTLV1 在植物感染模型中的复制及细胞间移动情况：在N. benthamiana中研究 NaTLV1 的复制和细胞间移动。接种叶片在接种后 1 - 14 天可检测到病毒 RNA，且随着时间积累增加；未接种的上部叶片在 7 天和 14 天未检测到病毒 RNA，且在接种叶片的未接种区域也未检测到病毒复制，表明 NaTLV1 可在N. benthamiana叶片中复制，但未观察到细胞间移动，不过因样本量小不能完全排除其存在细胞间移动的可能性。

讨论

真菌和植物病毒的进化关系复杂，已有研究发现部分真菌和植物病毒可跨界感染，这引发了对植物和真菌病毒起源的思考。

本研究鉴定的 NaTLV1 基因组含 10,301nt，4 个 ORF 和 poly（A）尾。ORF1 和 ORF2 编码蛋白与Tobamovirus属同源，基于 ICTV 分类标准和系统发育分析，NaTLV1 与Virgaviridae科关系密切，可能与其他相关真菌类烟草花叶病毒形成新属或新科。

NaTLV1 的 ORF3 编码的假定 MP 与多种病毒的相关蛋白有同源性，且类烟草花叶病毒假定 MP 比Virgaviridae科其他属的 MP 更长，其含 DEXDc 结构域，可能导致 NaTLV1 在N. benthamiana中缺乏细胞间移动能力。这表明 NaTLV1 及部分类烟草花叶病毒可能是通过感染不同真核生物（尤其是真菌和植物）的 RNA 病毒基因组片段重配和重组进化而来。

ORF4 编码的假定 CP 与已知序列核苷酸无同源性，但氨基酸序列与类烟草花叶病毒有同源性。系统发育分析显示，含 NaTLV1 的类烟草花叶病毒簇与Gammaflexiviridae和Betaflexiviridae科关系密切，其形态更接近这两个科的弯曲杆状病毒。

综上，NaTLV1 及其他类烟草花叶病毒可能是新的病毒属或科，与植物病毒科（Virgaviridae和Betaflexiviridae）和真菌病毒科（Gammaflexiviridae）密切相关，可能起源于共同祖先或在进化中发生重组。NaTLV1 的发现支持了真菌和植物病毒间的联系，拓展了对病毒多样性、分类和进化的认识。

材料与方法

1. 真菌、病毒、植物和引物：感染 NaTLV1 的N. aurantiaca菌株 A4 从污染的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板中意外分离，NaTLV1 阴性的 V1 菌株通过单分生孢子分离获得。N. benthamiana由华中农业大学邓应天教授提供。引物序列见补充材料 Table S4。
2. NaTLV1 RNA 提取、测序和生物信息学分析：用 EZNA Fungal RNA Kit 提取 A4 菌株总 RNA，构建文库后在 Illumina NovaSeq 6000 平台测序。对原始读数过滤、组装，通过多种软件和工具进行序列比对、丰度估计、全长基因组确认及系统发育树构建和结构域分析。
3. NaTLV1 在N. aurantiaca中的水平和垂直传播及真菌菌株特征分析：通过共培养评估 NaTLV1 的水平传播，用单分生孢子分离结合 RT - PCR 检测垂直传播效率。观察 A4 和 V1 菌株的表型，包括菌落形态、生长速率、产孢量，通过接种N. benthamiana叶片评估毒力。
4. 病毒粒子和真菌接种：用机械摩擦和涂抹两种方法将 NaTLV1 病毒粒子接种到N. benthamiana叶片，同时用含 A4 和 V1 菌株菌丝的凝胶块接种N. benthamiana叶片。
5. RT - PCR 确认病毒感染和 RT - qPCR：提取N. benthamiana叶片或N. aurantiaca菌丝总 RNA，合成 cDNA 后进行 RT - qPCR，以N. benthamiana EF1α RNA 为内参，实验重复 3 次，样本分析 3 次，用 Jamovi 软件分析数据。
6. 病毒粒子纯化和可视化：对真菌菌丝进行一系列处理后，通过蔗糖密度梯度超速离心纯化病毒粒子，将梯度分离为 6 个组分，对各组分沉淀进行透射电镜观察和粒子尺寸测量。
7. 病毒粒子单链 RNA 和蛋白质分析：用酚：氯仿：异戊醇提取各组分单链 RNA，经反转录、扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测。用 12% SDS - PAGE 分离各组分蛋白质，染色后切取蛋白条带进行肽质量指纹分析。

本研究受国家自然科学基金等项目资助，T.Z. 和 Y.T. 设计实验并撰写文章，M.H. 和 F.T. 进行实验和分析数据，Z.S. 和 H.L. 参与数据分析。