热休克蛋白 A1 通过伴侣介导的自噬降解病毒 RNA 聚合酶 3D 抑制口蹄疫病毒复制 —— 潜在治疗靶点的新发现

《Journal of Virology 4.0》：Heat shock protein A1 inhibits the replication of foot-and-mouth disease virus by degrading viral RNA polymerase 3D through chaperone-mediated autophagy

本文聚焦口蹄疫病毒（FMDV），研究发现热休克蛋白 A1（HSPA1）可通过伴侣介导的自噬（CMA）途径降解病毒 RNA 聚合酶 3D，抑制 FMDV 的 RNA 复制，干扰病毒感染，为 FMDV 感染防治提供了新的潜在靶点，极具研究价值。

　　

引言

口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）隶属小核糖核酸病毒科（Picornaviridae），是单链正链 RNA 病毒。其引发的口蹄疫（FMD）是一种急性、热性且高度传染的疾病，主要影响猪、牛、羊等偶蹄动物，被世界动物卫生组织（WOAH，前身为 OIE）列为须通报疾病，对畜牧业和动物及动物产品国际贸易构成严重威胁。

RNA 复制是理解 FMDV 致病机制的关键环节。病毒进入宿主细胞后释放基因组启动 RNA 复制，这一过程发生在细胞质中。FMDV 基因组约 8.3kb，编码 4 种结构蛋白和 8 种非结构蛋白，其中非结构蛋白 3D 作为 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp），在复制复合体（RC）中以病毒基因组 RNA 为模板合成负链 RNA，进而产生更多正链 RNA。

热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是一类应激诱导蛋白，广泛存在于原核和真核生物中，依据分子量和氨基酸序列相似性可分为 5 个家族。HSPA1 作为 HSPAs 家族成员，在肠道病毒 A71（EV-A71）感染中发挥重要作用，但它在 FMDV 生命周期中的角色尚不明确。本研究旨在探究 HSPA1 在 FMDV 感染中的作用机制。

材料和方法

1. 细胞和病毒：选用 PK-15（猪肾细胞）和 BHK-21（幼仓鼠肾细胞），从兰州兽医研究所获取，在添加 10% 胎牛血清、青霉素和链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基中，于 37°C、5% CO₂的湿润环境下培养。FMDV 血清型 O 株 O/China/99 由 WOAH / 中国国家口蹄疫参考实验室提供，在 BHK-21 细胞中增殖，通过 50% 组织培养感染剂量（TCID₅₀）测定病毒滴度。
2. 抗体和试剂：实验所需多种抗体购自 Proteintech、CWBIO、Beyotime 等公司，部分试剂如环己酰亚胺（CHX）、MG132 等购自 MedChemExpress，所有药物均溶解于 0.1% DMSO。
3. RNA 干扰：针对候选基因和阴性对照合成小干扰 RNA（siRNAs），由 Genepharma 公司合成。转染时，待细胞密度约 80%，按照 Lipofectamine RNAiMAX 说明书进行操作。
4. 质粒构建：实验室前期已合成 FMDV 非结构蛋白相关质粒和双荧光素酶质粒 psiCHECK-FMDV。构建 HA 标记的 HSPA1 质粒，从 PK-15 细胞中扩增 HSPA1 编码序列，插入 pCMV-HA-C 载体。同时构建 HSPA1 截断版本和突变的 Flag-3D 质粒，所有引物由擎科生物合成，DNA 构建体经测序验证。
5. 细胞活力检测：在 96 孔板中培养细胞，分别用指定药物处理 24 小时或转染特定 siRNAs、质粒 48 或 24 小时，采用 MTT 法检测细胞活力。
6. RNA 提取和定量实时 PCR：使用 RNAi Plus 提取细胞总 RNA，经反转录合成 cDNA，利用定量实时 PCR（RT-qPCR）检测 FMDV 和 GAPDH 转录水平，通过特定引物检测病毒负链 RNA。
7. 病毒滴定：采用终点稀释法测定病毒感染性，利用 Reed-Muench 方法计算 TCID₅₀。
8. 免疫沉淀测定：用 RIPA 缓冲液裂解 PK-15 细胞，离心后取上清进行免疫沉淀，与 Protein G - 琼脂糖珠孵育，洗涤后洗脱用于免疫印迹分析。
9. 双荧光素酶报告基因测定：在 PK-15 细胞中进行过表达或敲低实验，转染相应质粒，孵育后裂解细胞，按照双荧光素酶报告基因检测系统说明书测定萤火虫荧光素酶（FLuc）和海肾荧光素酶（RLuc）活性，评估 FMDV - 5′UTR 启动子相对活性。
10. 免疫印迹测定：用 SDS 上样缓冲液裂解细胞提取总蛋白，经变性、SDS-PAGE 分离后转移至硝酸纤维素膜，依次进行封闭、孵育一抗、洗涤、孵育二抗、洗涤，最后用增强化学发光检测试剂显影。
11. 空斑测定：细胞密度达 90% 时，将病毒稀释后加入六孔板，吸附 1 小时后弃病毒液，加入黄蓍胶培养基继续孵育 48 小时，随后固定、染色并观察结果。
12. 统计分析：多数实验采用单因素方差分析评估组间差异显著性，在评估 HSPA1 对 FMDV 进入阶段影响时采用学生 t 检验，以 P < 0.05 为差异有统计学意义。

结果

1. HSPA1 抑制 FMDV 感染：构建 HA 标记的 HSPA1 过表达质粒（HA-HSPA1）转染 PK-15 细胞，感染 FMDV 后，与空载体组相比，过表达组病毒 RNA 水平、病毒滴度显著降低，病毒结构蛋白水平也受到抑制。筛选出最有效的 HSPA1 siRNA（si1629，即 siHSPA1）进行敲低实验，结果显示敲低 HSPA1 后，病毒 RNA 水平和滴度显著增加，病毒蛋白水平升高，表明 HSPA1 对 FMDV 感染有抑制作用。
2. HSPA1 抑制 FMDV 的 RNA 复制：通过实验验证 HSPA1 不影响 FMDV 的进入阶段。在 RNA 复制阶段，过表达 HSPA1 显著降低 FMDV 总 RNA 和负链 RNA 水平，敲低 HSPA1 则使二者升高。双荧光素酶报告基因实验表明 HSPA1 不影响 FMDV 5′UTR 的翻译效率，综合证明 HSPA1 抑制 FMDV 的 RNA 复制。
3. HSPA1 对 FMDV 的 3D 蛋白有降解作用：共过表达 HSPA1 和不同 FMDV 非结构蛋白质粒，发现 HSPA1 显著抑制 3D 蛋白表达。CHX 实验显示 HSPA1 促进 3D 蛋白降解，感染实验进一步证实 HSPA1 表达变化与 3D 蛋白水平呈负相关，免疫沉淀实验表明 HSPA1 直接与 3D 聚合酶结合，说明 HSPA1 通过直接结合并促进 3D 聚合酶降解来抑制病毒 RNA 复制。
4. HSPA1 通过其肽结合结构域直接结合 3D：构建 HSPA1 截断版本质粒，分别包含 ATP 结合结构域（HA-HSPA1 - 1 - 385）和肽结合结构域（HA-HSPA1 - 386 - 640），与 3D 质粒共转染 PK-15 细胞，免疫沉淀实验表明 3D 蛋白与 HSPA1 的肽结合结构域特异性结合。使用 Apoptozole 抑制 HSPA1 的 ATP 结合结构域，发现其抑制了 HSPA1 对 3D 蛋白的降解作用，且该抑制剂在实验剂量范围内细胞毒性较小，表明 HSPA1 通过肽结合结构域结合 3D 蛋白，ATP 结合结构域在降解过程中也起关键作用。
5. HSPA1 通过伴侣介导的自噬途径促进 3D 的降解：使用针对蛋白酶体、自噬和凋亡途径的抑制剂处理细胞，发现自噬抑制剂抑制了 HSPA1 对 3D 蛋白的降解作用。进一步研究发现，HSPA1 介导的 3D 蛋白降解不太可能通过宏观自噬途径，而是主要通过伴侣介导的自噬（CMA）途径。激活 CMA 途径（使用 CA77.1）降低了 3D 蛋白水平，敲低 CMA 途径的关键受体 LAMP2A 则阻断了 HSPA1 对 3D 蛋白的降解作用。
6. CMA 途径降解 3D 的关键基序：FMDV 3D 蛋白含有两个潜在的 KFERQ 样基序，通过丙氨酸扫描诱变构建 10 个突变 3D 质粒，发现₄₂₁QEKLI₄₂₅基序突变会消除 HSPA1 的降解作用，而₁₆₀QTFLK₁₆₄基序突变影响较小。此外，HSPA1 也能介导含有 QEKLI 基序的 3BCD 前体蛋白降解，且该基序在不同小核糖核酸病毒 3D 蛋白序列中具有特异性，表明 HSPA1 通过 CMA 途径识别₄₂₁QEKLI₄₂₅基序来降解 3D 蛋白。
7. 阻断 CMA 途径促进 FMDV 感染：敲低 LAMP2A 阻断 CMA 途径后感染 FMDV，结果显示病毒 RNA 水平显著增加，但病毒蛋白水平和滴度无明显变化，表明阻断 CMA 途径促进了病毒 RNA 复制，支持 CMA 途径抑制 FMDV 复制的结论。

讨论

热休克蛋白（HSPs）在细胞应对各种应激包括病毒感染时表达增加，参与多种细胞活动，其中 HSPA 家族与病毒感染关系密切，在不同病毒感染中发挥不同作用。在小核糖核酸病毒家族中，HSPA1 在 EV-A71 感染中起促进作用，而本研究发现其对 FMDV 感染起抑制作用，这种差异可能源于两种病毒不同的复制机制。

FMDV 感染过程包括与细胞表面受体结合、释放基因组 RNA、翻译和加工多聚蛋白、合成病毒 RNA、装配和释放病毒粒子。HSPA1 主要抑制 FMDV RNA 复制阶段，通过降解病毒 3D 蛋白，减少负链 RNA 合成，从而抑制病毒复制。HSPA1 与 3D 蛋白结合并促进其降解，该过程涉及 HSPA1 的肽结合结构域和 ATP 结合结构域，是一个能量依赖的过程。

在探究 HSPA1 降解 3D 蛋白的途径时，发现不太可能是宏观自噬途径，而主要是通过 CMA 途径。CMA 途径具有选择性，识别含有 KFERQ 样基序的蛋白，₄₂₁QEKLI₄₂₅是 HSPA1 介导 3D 蛋白降解的关键基序。HSPA1 可能通过其伴侣功能使 3D 蛋白展开，暴露该基序，进而被 CMA 途径识别降解。

敲低 LAMP2A 阻断 CMA 途径后，病毒 RNA 水平增加，但病毒蛋白和滴度未明显变化，推测是由于细胞翻译机制未受影响，虽有更多病毒 RNA，但无法包装更多子代病毒。

综上所述，本研究表明 HSPA1 通过 CMA 途径降解病毒 3D 蛋白，抑制 FMDV RNA 复制和感染，揭示了 HSPA1 在 FMDV 感染中的重要作用机制，为 FMDV 感染的防治提供了潜在的治疗靶点。